?BrdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒

貨號：ZK-PL4012

描述：BrdU檢測試劑盒用于細(xì)胞和組織切片的細(xì)胞增殖檢測。BrdU(5-Bromo-2-deoxyUridine)，即5-溴脫氧尿嘧啶核苷，是胸腺嘧啶核苷(T)類似物，檢測原理為BrdU可以通過競爭替代胸腺嘧啶核苷T摻入DNA合成期(S期)。當(dāng)處于旺盛分裂的細(xì)胞摻入BrdU后，利用抗BrdU抗體和抗體連接酶或熒光素作為指示系統(tǒng)，即可檢測出含有BrdU的細(xì)胞，結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行雙重標(biāo)記，可判斷出增殖細(xì)胞的種類、增殖速度等，對研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。BrdU經(jīng)活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)進(jìn)入組織細(xì)胞，摻入DNA定位準(zhǔn)確，可有效反應(yīng)S期細(xì)胞新合

成DNA的水平，而且受細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境影響小，標(biāo)記不會丟失。

組成:

操作步驟:

細(xì)胞樣品：

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備：提前準(zhǔn)備細(xì)胞爬片，確保細(xì)胞狀態(tài)正常，貼壁良好；

2. BrdU孵育：細(xì)胞經(jīng)含BrdU的培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中避光孵育一定時(shí)間，BrdU濃度及細(xì)胞孵育時(shí)間依據(jù)細(xì)胞種類不同，建議預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳條件。注意事項(xiàng)中已測試細(xì)胞實(shí)驗(yàn)條件可供參考；

3. 細(xì)胞固定：上述經(jīng)BrdU孵育的細(xì)胞爬片，PBS洗3次，每次5min。向孔板內(nèi)加入1mL 4%多聚甲醛覆蓋細(xì)胞，室溫固定20-30min。PBS洗3次，每次5min；

4. 通透：向孔板內(nèi)滴加破膜液覆蓋細(xì)胞處理8-10min，PBS洗3次，每次5min；

5. 細(xì)胞核染色（可選）：

若后續(xù)白光檢測，則用蘇木素染細(xì)胞核：向孔板內(nèi)滴加蘇木素染液室溫染色5min，吸棄蘇木素染液，PBS洗3次，每次5min；

若后續(xù)熒光檢測，則用DAPI染細(xì)胞核：向孔板內(nèi)滴加DAPI染液室溫染色5min，吸棄DAPI染液，PBS洗3次，每次5min；

6. 再固定：向孔板內(nèi)滴加4%多聚甲醛室溫孵育10min，PBS洗3次，每次5min；

7. 酸化：向孔板內(nèi)滴加1M HCl覆蓋細(xì)胞，37℃處理10min，PBS洗3次，每次5min；

8. 后固定：再次向孔板內(nèi)滴加4%多聚甲醛室溫孵育10min，PBS洗3次，每次5min；

9. 封閉：向孔板內(nèi)滴加封閉液（3% BSA）室溫孵育30min。吸棄封閉液，不要清洗；

10. Anti-BrdU抗體孵育：向孔板內(nèi)滴加anti-BrdU一抗工作液覆蓋細(xì)胞，4℃孵育過夜。吸棄anti-BrdU一抗工作液，PBS洗3次，每次5min；

11. 二抗孵育：向孔板內(nèi)滴加二抗工作液覆蓋細(xì)胞，室溫孵育1h。吸棄二抗工作液，PBS洗3次，每次5 min。注意，若是用熒光標(biāo)記的二抗，孵育及洗滌時(shí)均需避光；

12. 封片及鏡檢：

若是HRP標(biāo)記的二抗(C1308)，則用DAB顯色試劑對細(xì)胞樣品進(jìn)行顯色，脫水，透明，用尖頭鑷子輕輕將爬片挑起，倒扣在潔凈的載玻片上封片，顯微鏡觀察；

若是熒光標(biāo)記的二抗，在潔凈載玻片上滴加抗熒光衰減封片劑（C1210），用尖頭鑷子輕輕將爬片挑起，倒扣在載玻片上封片，熒光顯微鏡觀察；

組織切片樣品：

1. 動(dòng)物準(zhǔn)備：需提前準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并進(jìn)行體內(nèi)BrdU標(biāo)記。體內(nèi)標(biāo)記后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行取材、固定及制備石蠟切片；

2. 組織石蠟切片脫蠟復(fù)水；

3. 修復(fù)：組畫筆畫圈圈住組織，將切片浸沒在抗原修復(fù)液中，微波加熱修復(fù)。自然冷卻；

4. 細(xì)胞核染色（可選）：

若后續(xù)白光檢測，則用蘇木素染細(xì)胞核：切片入蘇木素染液室溫染色5min，PBS洗3次，每次5min；

若后續(xù)熒光檢測，則用DAPI染細(xì)胞核：向組織上滴加DAPI染液室溫染色5min，傾去DAPI染液，切片經(jīng)PBS洗3次，每次5min；

5. 再固定：向組織上滴加4%多聚甲醛室溫孵育10min，PBS洗3次，每次5min；

6. 酸化：向切片上滴加1 M HCl覆蓋組織，37℃處理10min，PBS洗3次，每次5min；

7. 后固定：再次向切片上滴加4%多聚甲醛覆蓋組織室溫孵育10min，PBS洗3次，每次5min；

8. 內(nèi)源性過氧化物酶淬滅（可選）：向切片上滴加3% H2O2室溫孵育25-30min，去除內(nèi)源性過氧化物酶。隨后切片經(jīng)PBS洗3次，每次5min；

9. 封閉：向切片上滴加封閉液（3% BSA）覆蓋組織，室溫孵育30min。去除封閉液，不要清洗；

10. Anti-BrdU抗體孵育：向切片上滴加anti-BrdU一抗工作液覆蓋組織，4℃孵育過夜。去除anti-BrdU一抗工作液，PBS洗3次，每次5min；

11. 二抗孵育：向切片上滴加二抗工作液覆蓋組織，室溫孵育1h。去除二抗工作液，PBS洗3次，每次5 min。注意，若是用熒光標(biāo)記的二抗，孵育及洗滌時(shí)均需避光；

12. 封片及鏡檢：

若是HRP標(biāo)記的二抗(C1308)，則用DAB顯色試劑對組織切片進(jìn)行顯色，脫水，透明，封片后顯微鏡觀察；

若是熒光標(biāo)記的二抗，則滴加抗熒光淬滅封片劑（C1210）封片后熒光顯微鏡觀察。

結(jié)果觀察

如果用HRP標(biāo)記的二抗檢測，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，增殖細(xì)胞呈棕色。如果是熒光標(biāo)記的二抗，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光（Ex=358 nm，Em=461 nm），增殖細(xì)胞為對應(yīng)二抗的熒光。

注意事項(xiàng)

1. 對于細(xì)胞爬片樣品，BrdU的使用濃度和處理時(shí)間與細(xì)胞種類有關(guān)。一般來說，處理腫瘤細(xì)胞所需濃度和時(shí)間都較低，成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞等增殖較慢的細(xì)胞需要提高濃度并延長作用時(shí)間，建議濃度范圍為20-100μM，作用時(shí)間為40min-4h，可根據(jù)具體細(xì)胞的種類進(jìn)行摸索調(diào)整。

下表為測試的常用細(xì)胞處理濃度及時(shí)間，僅供參考。

2. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。