?Click EdU-555細胞增殖檢測試劑盒

貨號：ZK-PL4014

描述：

EdU（5-Ethynyl-2'- deoxyuridine，5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷）是一種含有一個乙炔基團的胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，當將其注射到動物體內(nèi)或者對體外培養(yǎng)的細胞進行孵育，這些小分子能夠迅速擴散到各個器官組織，并滲入到細胞中，可以在細胞增殖時期代替胸苷（T）摻入到新合成的 DNA 中。EdU分子中的乙炔基團能與熒光標記的疊氮化合物探針在銅離子催化下發(fā)生“點擊”反應形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，因此可以使新合成的 DNA 被相應的熒光探針所標記。EdU 檢測法同放射性標記核苷摻入法相比，沒有放射性污染等限制因素；同 BrdU 檢測法相比，EdU 檢測法不需要 DNA 的變性處理，也不用抗原抗體反應，這大大減少了實驗的復雜性和時間，也使其變得更省時、更靈敏、更穩(wěn)定和更準確。本試劑盒可用于檢測體外培養(yǎng)的細胞或動物組織中細胞增殖情況。本試劑盒中熒光探針為紅色熒光，最大激發(fā)波長為 557nm，最大發(fā)射波長為 570 nm，處于增殖的細胞被標記后，細胞核會顯示出明紅色熒光，通過配套常規(guī)細胞核染料共同標記細胞核（本試劑盒提供 Hoechst 33342 細胞核染料），可用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等儀器直接觀察細胞增殖情況；也可以使用流式細胞儀檢測體外培養(yǎng)細胞群熒光強度，根據(jù)熒光強度，來判斷細胞周期中 S 期的 DNA 復制活性。

儲存與運輸
冰袋（wet ice）運輸；-20℃避光保存，EdU催化試劑(試劑 A)及反應緩沖液可4℃保存；有效期12個月。

組成：100次
EdU 儲存液（10 mM）：100μL
試劑 A（催化試劑）：120μL
試劑 B（熒光染料 iF555）：50μL
試劑 C（催化添加劑）：2×100mg（powder）
反應緩沖液：20mL
Hoechst33342染色液：30μL

操作步驟

1.體外細胞樣品以及試劑準備工作：

1.1.將細胞按一定密度均勻種植于細胞培養(yǎng)板中（種植密度，由細胞大小、生長快慢等因素決定），待細胞貼壁或恢復正常狀態(tài)后，進行相應的藥物刺激等處理（如檢測懸浮細胞，請按懸浮細胞常規(guī)操作方式進行，整體實驗均需添加離心等步驟）
1.2. 試劑C（催化添加劑）低速離心，加入1mL超純水溶解，并分裝后于-20℃存放備用
2. 體外細胞 EdU 標記、固定及通透：
2.1.配制 2×EdU孵育工作液：每1mL 完全細胞培養(yǎng)基中加入2μL EdU 存儲液（10 mM），即為 20μM 的 2×EdU 孵育工作液，并放入培養(yǎng)箱中預熱（建議預實驗以 EdU 工作濃度為 10 μM 進行摸索）
2.2.以半換液的模式，將培養(yǎng)板中原細胞培養(yǎng)基吸除一半，并補加等體積預熱的 2×EdU 孵育工作液，
孵育一定的時間（孵育的時間一般取決于對應的細胞生長周期，通常占細胞周期 10%左右的時間。對于大北京普利萊基因技術(shù)有限公司 電話 010-62053186, 62027915 Email：多貼壁且生長較快的細胞，建議孵育 2 h 左右。具體情況，需要隨細胞特性、處理后實際情況等進行調(diào)整。如需孵育較長時間可適當降低 EdU 工作濃度；較短時間則可適當提高 EdU 濃度）
2.3.將EdU標記孵育后的細胞樣品，用PBS緩沖液清洗1-2次后，加入固定液，覆蓋細胞即可，室溫固定15min（如需用流式檢測，貼壁細胞此步之前先消化重懸后再固定，后續(xù)按懸浮細胞的處理方式即可）；用 PBS 緩沖液洗滌 2-3 次，每次 3-5 min；
2.4.去除PBS緩沖液，加入通透液，覆蓋細胞或組織即可，室溫孵育 15 min；
2.5. 去除通透液后使用 PBS 緩沖液洗滌 1-2 次，每次 3-5 min，然后轉(zhuǎn)至步驟 4。3. 動物 EdU 注射造模以及組織切片處理：
3.1. 根據(jù)實驗要求，以腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、尾靜脈注射等方式對動物進行一次或多次 EdU注射造模，一般實驗 EdU 用量和動物體重的比值為 5 mg/kg，具體注射量根據(jù)研究內(nèi)容和動物情況而定。本試劑盒中提供部分 EdU 儲存液，主要用于體外細胞 EdU 標記，如需對動物進行 EdU 造模，可單獨訂購 EdU試劑；
3.2. 小腸等上皮組織細胞增殖速度快，大腦等組織細胞增殖速度慢，生長較快的組織部位通常標記時間小于 12 小時，而生長較慢的組織標記時間可能需幾天；最佳標記時間根據(jù)具體實驗而定，由于小腸上皮組織增殖較快，建議取該類組織作為標記參考；
3.3. 將造模動物按照規(guī)定標準處死后，取出所需的組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片；
a. 對于冰凍切片：放置恢復到室溫，加入適量固定液，室溫固定 15 min。去除固定液，用適量 PBS 緩沖液洗滌 3 次，每次 3-5 min；去除 PBS 緩沖液，用適量通透液覆蓋組織室溫孵育 10-15 min；去除通透液，用 PBS 緩沖液洗滌 1-2 次，每次 3-5 min，然后轉(zhuǎn)至步驟 4。
b. 對于石蠟切片：切片脫蠟復水，PBS 洗滌 5 min。去除 PBS 緩沖液，加入通透液，覆蓋細胞或組織即可，室溫孵育 15 min；去除通透液后使用 PBS 緩沖液洗滌 1-2 次，每次 3-5 min，然后轉(zhuǎn)至步驟 4。
4. EdU 點擊反應：
4.1. 在細胞或組織固定和穿孔期間，配制點擊反應液（對于不同樣本配制體系參考以下表中方案）對于體外培養(yǎng)細胞：本參考步驟是對應 10 個 96 孔板樣品的體積用量（每孔 100 μL），可根據(jù)使用需求，等比例增加或減少配制量，請按下表順序依次添加組分，邊加邊混勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）；
反應緩沖液 935 μL
試劑 A：催化試劑 10 μL
試劑 B：熒光染料 iF5555 μL
試劑 C：催化添加劑 50 μL
總體積
1000 μL
對于組織細胞切片：參考下體系進行點擊反應液體系的配制，可根據(jù)切樣本數(shù)，等比例增加或減小配制量，每個切片樣本約用 100-200 μL 點擊反應液覆蓋。
反應緩沖液 928 μL
試劑 A：催化試劑10 μL
試劑 B：熒光染料 iF555 12 μL
試劑 C：催化添加劑 50 μL
總體積 1000 μL
4.2.去除上一步（步驟2.5或3.3）PBS 緩沖液，加入點擊反應液，輕搖保證反應液全部覆蓋細胞或組織，室溫避光孵育 30 min；
4.3.去除點擊反應液，PBS緩沖液洗滌 2-3 次，每次3-5min（如無其他特別要求，即可用流式細胞儀檢測其熒光強度或用其他儀器檢測熒光效果）。
5. 細胞核染色：
5.1.去除上一步PBS緩沖液，將 Hoechst 33342染色液與 PBS 緩沖液以1比500-1000比例稀釋后，加入覆蓋細胞，孵育 5min；
5.2.去除 Hoechst 33342 染色液，PBS 緩沖液洗滌2-3次，每次3-5min。
6.成像以及檢測分析
直接將體外培養(yǎng)的細胞或者組織切片樣品置于熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡等儀器檢測，分析處于增殖的細胞占比；或者收集體外培養(yǎng)的細胞，用流式細胞儀檢測熒光強度（建議使用未經(jīng) EdU 標記的細胞樣品作為流式細胞儀檢測的陰性對照，并選擇合適的電壓），根據(jù)熒光強度，來判斷細胞周期中 S 期的 DNA 復制活性。本試劑盒試劑 B：（熒光染料 iF555）對應的光譜特性為 Ex/Em：557 nm/570 nm（紅色）；Hoechst 33342染色液對應的光譜特性為 Ex/Em：346 nm/460 nm（藍色）。

注意事項
1. 對于體外培養(yǎng)細胞，具體 EdU 使用濃度、孵育時間隨樣品以及研究目的的不同，可進行適當調(diào)整。
2. 部分組織細胞增殖速度緩慢，為了排除造模效果不佳等因素，建議選增殖快的組織樣品作為參照樣本（如腸道組織）。
3. 如果背景顏色過深，可能是實驗中洗滌不充分、組織樣品固定時間過長、固定液殘余導致。
4. 試劑C：（EdU 催化添加試劑）易氧化，盡量避免長時間暴露于空氣中，配制成水溶液后，建議分裝保存；經(jīng)測試，如 EdU 催化添加試劑顏色發(fā)生輕微變化，點擊反應催化體系依舊能夠正常進行，如呈現(xiàn)棕色，表明該組分已失效，請棄用。
5. 操作時請穿實驗服，佩戴一次性手套。