?活性氧ROS檢測(cè)試劑盒（紅色熒光）

貨號(hào)：ZK-PL3955

規(guī)格：100-500次?

描述：

本試劑盒利用熒光探針DHE進(jìn)行活性氧檢測(cè)。DHE可自由透過(guò)活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞質(zhì)中呈藍(lán)色熒光，被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化后形成氧化乙啶摻入染色體DNA中，使細(xì)胞核呈現(xiàn)明亮的紅色熒光。在激發(fā)波長(zhǎng)535nm，發(fā)射波長(zhǎng)610nm附近，使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等檢測(cè)熒光強(qiáng)度，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。具有背景低、靈敏度高、線性范圍寬、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，是一種快速簡(jiǎn)便的組織或培養(yǎng)活細(xì)胞中ROS經(jīng)典檢測(cè)方法。

適用范圍：

貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、新鮮動(dòng)物組織

工作波長(zhǎng)：

激發(fā)波長(zhǎng)480-535nm，最佳發(fā)射波長(zhǎng)590-610nm

組成：

0.2ml, 5mM DHE，-20 oC避光保存 一年有效

所需設(shè)備：流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計(jì)等

操作步驟：

一、 細(xì)胞樣本：

1. 收集細(xì)胞，進(jìn)行活性氧測(cè)定

1.1 細(xì)胞收集：懸浮細(xì)胞：2000rpm，離心5min，收集沉淀，用0.01M PBS或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2次，1000rpm，離心5min，棄上清，取細(xì)胞沉淀；貼壁細(xì)胞：吸去培養(yǎng)液，用0.01M PBS或無(wú)血清培養(yǎng)液反復(fù)吹打，使細(xì)胞層全部進(jìn)入PBS或培養(yǎng)液中，收集細(xì)胞懸液，用0.01M PBS或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2次，1000rpm，離心5min，棄上清，取細(xì)胞沉淀；

1.2加入DHE探針：用稀釋好的DHE熒光探針重懸細(xì)胞沉淀，一般情況下，細(xì)胞密度要求1*106-2*107/ml，推薦探針初始工作濃度為10 μM（DHE工作濃度可在1μM~100 μM范圍內(nèi)，需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最適濃度）。

1.3 37 oC孵育細(xì)胞10分鐘~90分鐘。通常情況下，10-30分鐘即可。注意：孵育時(shí)間長(zhǎng)短與細(xì)胞類(lèi)型、刺激條件、DHE濃度等有關(guān)?？梢悦扛?min顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

1.4 1000g，離心5min，去上清收集細(xì)胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌2次，重懸細(xì)胞。

1.5 進(jìn)行熒光檢測(cè)，以熒光度數(shù)值表示結(jié)果。

2. 不收集細(xì)胞，直接將探針加入培養(yǎng)基測(cè)定

2.1 加入DHE探針：去除細(xì)胞培養(yǎng)基上清，加入用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋好的DHE探針（推薦探針終濃度為10 μM），加入探針的體積以能蓋住細(xì)胞為宜，通常6孔板單孔不少于500 μl。

2.2 37oC孵育細(xì)胞10分鐘~90分鐘。通常情況下，10-30分鐘即可。注意：孵育時(shí)間長(zhǎng)短與細(xì)胞類(lèi)型、刺激條件、DHE濃度等有關(guān)?？梢悦扛?min顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

2.3 棄去上層培養(yǎng)液，用0.01M PBS或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2次，去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針。

2.4 進(jìn)行熒光檢測(cè)，以熒光度數(shù)值表示結(jié)果。

二、 動(dòng)物組織樣本

1.1 細(xì)胞懸液制備：可采用單細(xì)胞懸液制備儀或傳統(tǒng)的組織處理方法如：酶解法、研磨法等制備單細(xì)胞懸液；

1.2 加入DHE探針，加入DHE探針：去除細(xì)胞培養(yǎng)基上清，加入用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋好的DHE探針（推薦探針終濃度為10μM）。

1.3 37oC孵育細(xì)胞10分鐘~90分鐘。通常情況下，10-30分鐘即可。注意：孵育時(shí)間長(zhǎng)短與細(xì)胞類(lèi)型、刺激條件、DHE濃度等有關(guān)?？梢悦扛?min顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

1.4 1000g，離心5min，去上清收集細(xì)胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌2次，重懸細(xì)胞

1.5 進(jìn)行熒光檢測(cè)，以熒光度數(shù)值表示結(jié)果。

注意事項(xiàng)：

（1）開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集于管底，避免開(kāi)蓋時(shí)染液損失。

（2）要設(shè)有無(wú)DHE孵育的對(duì)照，即不加探針，只用0.01M PBS重懸的細(xì)胞。

（3）熒光探針標(biāo)記后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，以避免背景升高。多次清洗時(shí)注意操作規(guī)范，避免將細(xì)胞洗掉。

（4）對(duì)于藥物處理（孵育）時(shí)間較短的細(xì)胞（2小時(shí)以?xún)?nèi)、也有建議4小時(shí)以?xún)?nèi)），可以先用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，后用藥物刺激細(xì)胞后。對(duì)于藥物處理時(shí)間較長(zhǎng)的細(xì)胞（超過(guò)4小時(shí)或6小時(shí)以上），建議先用藥物處理（刺激）細(xì)胞，后用探針標(biāo)記。

（5）DHE在光照和空氣中易被氧化，保存和操作中應(yīng)注意避光。

（6）對(duì)不同的細(xì)胞和組織，應(yīng)選擇合適的孵育時(shí)間和濃度，以觀察ROS的變化。

（7）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。