子科生物報道：近日，華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室謝卡斌課題組建立了一種陣列式CRISPR文庫用于大規(guī)模植物基因編輯的方法。利用此方法，該課題組創(chuàng)建了靶向敲除1072個水稻類受體激酶的基因編輯材料，為快速鑒定抗病、抗逆相關(guān)的基因提供了新資源。基于此，該團隊以“A FLASH pipeline for arrayed CRISPR library construction and the gene function discovery of rice receptor-like kinases”為題在Molecular Plant期刊上在線發(fā)表了研究論文”

隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在植物中的日益成熟，利用CRISPR文庫進行高通量的遺傳篩選成為可能。目前有兩種 CRISPR 文庫構(gòu)建策略：混合型文庫（pooled library）和陣列式文庫（arrayed library）。其中，混合型的CRISPR/Cas9文庫已被多個實驗室用于水稻、玉米、番茄等作物的突變體庫的構(gòu)建，但目前尚未有陣列式CRISPR文庫在植物中應用的報道。

本研究建立了一種陣列式CRISPR庫的快速構(gòu)建技術(shù)，可同時用于小規(guī)模和大規(guī)模植物基因編輯材料的創(chuàng)制。作者設計了一種PCR片段長度作為Cas9/gRNA載體標簽的策略（PCR fragment-length markers for gRNAs distinguishing，簡稱FLASH標簽），可以通過常規(guī)PCR和凝膠電泳讀取每個載體和轉(zhuǎn)化植株的gRNA信息（即靶基因信息）。本研究中，課題組設計了12個含不同F(xiàn)LASH標簽的CRISPR/Cas載體，并與96孔板高通量克隆技術(shù)結(jié)合，建立了快速構(gòu)建Cas9/gRNA質(zhì)粒文庫的方法。本研究還設計了將含不同F(xiàn)LASH標簽的12個質(zhì)粒載體混合后轉(zhuǎn)化水稻的策略，通過PCR檢測轉(zhuǎn)化植株所含F(xiàn)LASH標簽的片段大小即可讀取gRNA信息，極大地簡化了基因編輯材料的創(chuàng)制過程。

利用FLASH 標簽的載體系統(tǒng)構(gòu)建植物突變體庫的流程

利用FLASH策略，本研究在一年左右的時間內(nèi)完成了靶向編輯1072個水稻類受體激酶的構(gòu)建工作。課題組以12個載體混合轉(zhuǎn)化水稻的方式，通過89個水稻轉(zhuǎn)化事件獲得了5039棵T0代水稻植株；通過PCR檢測FLASH標簽的方式讀取了每株植物的gRNA信息，成功獲得了955個RLK基因的編輯水稻。對部分材料的基因型鑒定結(jié)果表明，目標基因的編輯效率在90%以上。

靶向編輯水稻RLK基因家族

本研究對脫靶編輯、無T-DNA整合的基因編輯事件也進行了詳細分析，并對15個基因的材料進行了稻瘟病接種試驗，鑒定到了9個抗稻瘟病相關(guān)的基因。最后，課題組討論了該方法的優(yōu)缺點，并提出了構(gòu)建全基因組規(guī)模的陣列式CRISPR文庫的協(xié)作方案。

利用 FLASH 基因編輯流水線擴大陣列式 CRISPR 文庫的協(xié)作方案