深圳子科生物報道：直接在臨床分離的多重耐藥菌中進(jìn)行功能基因組學(xué)研究是解析耐藥機制以及開發(fā)抗耐藥策略最直接有效的方法。然而，由于缺乏能在臨床耐藥菌中直接進(jìn)行高效基因編輯的工具，目前耐藥機制仍主要是采用組學(xué)分析加在模式菌中的異源驗證進(jìn)行研究。這種脫離了臨床耐藥菌本身遺傳背景的研究策略，往往忽略了遺傳背景本身對耐藥因子的影響以及不同耐藥因子之間的相互關(guān)系，很多時候無法對臨床抗耐藥研發(fā)提供真正有效的依據(jù)。開發(fā)一種能與臨床菌復(fù)雜各異的基因型兼容、并且簡便高效的基因組編輯方法將有助于我們打破這一研究壁壘。

中國科學(xué)院微生物研究所向華團(tuán)隊長期從事微生物CRISPR-Cas系統(tǒng)分子機制的研究，在致力于開發(fā)基因編輯新元件新機制的同時，近年來積極倡導(dǎo)利用原核微生物自身的CRISPR-Cas系統(tǒng)發(fā)展重要原核微生物基因組編輯技術(shù)，推動對微生物世界生命機制更加深入系統(tǒng)理解和開發(fā)應(yīng)用。

11月5日，向華團(tuán)隊和香港大學(xué)閆愛新團(tuán)隊聯(lián)合在Cell Reports上發(fā)表了題為“Native CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing Enables Dissecting and Sensitizing Clinical Multidrug-Resistant P. aeruginosa” 的文章。作者以多重耐藥研究中最重要的標(biāo)準(zhǔn)參照病原菌銅綠假單胞菌作為研究對象，報道了在臨床多重耐藥銅綠假單胞菌中開發(fā)基于內(nèi)源性I-F型 CRISPR的、高效簡便的基因編輯系統(tǒng)，并在該系統(tǒng)的輔助下，實現(xiàn)了在臨床多重耐藥菌株自身遺傳背景下耐藥機制的原位解析和抗耐藥化合物的篩選。

銅綠假單胞菌是當(dāng)前亟需關(guān)注的七種病原細(xì)菌“ESKAPE”（腸球菌屬，金黃色葡萄球菌，克雷伯菌，鮑曼不動桿菌，銅綠假單胞菌和腸桿菌屬）之一。由于該病原菌極易產(chǎn)生多重耐藥性，現(xiàn)有的抗生素療法不僅不能有效地根治其感染，阻止耐藥性的傳播，還會破壞宿主的益生菌群，對人體健康產(chǎn)生極大的副作用。

早先，閆愛新團(tuán)隊對2015-2016年香港瑪麗醫(yī)院各種感染性疾病包括傷口、尿道、耳部、膿液、引流液及血液感染的患者中分離的銅綠假單胞菌進(jìn)行了耐藥檢測并報道了一株有潛在流行性特征的多重耐藥菌PA154197。然而，研究人員嘗試了傳統(tǒng)的雙交換同源重組策略和基于外源Cas9的雙載體編輯系統(tǒng)均未能實現(xiàn)對該菌株基因組的編輯，這嚴(yán)重阻礙了對其耐藥性機制的深入解析。

全基因組測序結(jié)果顯示PA154197含有1個完整的內(nèi)源性I-F型CRISPR-Cas系統(tǒng)。他們通過與中科院微生物所向華研究團(tuán)隊合作，基于該系統(tǒng)共同開發(fā)出了一套具有抗性基因和報告基因雙篩選標(biāo)記的單質(zhì)?；蚓庉嬒到y(tǒng)。該系統(tǒng)包含一個由強啟動子（Ptat）驅(qū)動的mini-CRISPR元件（用于表達(dá)crRNA）和luminescence報告基因（luxCDABE）（用于輔助陽性克隆篩選），并同時含有同源重組的donor片段和用于克隆篩選的卡那霉素抗性基因。通過電轉(zhuǎn)法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入PA154197后，研究人員通過對具有明顯熒光信號的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行進(jìn)一步PCR及測序驗證，能夠快速（一周以內(nèi)）獲得陽性克隆，并同時實現(xiàn)了對其基因組高效、多樣化的精準(zhǔn)編輯（包括基因敲除，DNA插入和定點突變等）。

值得一提的是，基于熒光信號的陽性克隆初篩策略巧妙地規(guī)避了耐藥菌在抗生素篩選下假陽性率高的難題，大大降低了克隆篩選的工作量。進(jìn)一步的研究表明這一系統(tǒng)也適用于其它含有I-F型CRISPR的環(huán)境和臨床銅綠假單胞菌株，如分離自北太平洋的Ocean-100和另一株臨床菌株P(guān)A150567。

臨床多重耐藥銅綠假單胞菌基因組編輯、耐藥機制解析及防治策略

基于這套高效的基因編輯系統(tǒng)和前期的基因組與轉(zhuǎn)錄組分析，研究人員構(gòu)建了一系列突變菌株并揭示了PA154197中三個關(guān)鍵的耐藥突變 （mexR:T226G; mexT:8bp 缺失；gyrA:T248C）以及它們之間顯著的協(xié)同關(guān)系。隨后利用這一系列突變菌株對多種抗菌化合物進(jìn)行了耐藥性檢測，研究人員發(fā)現(xiàn)該耐藥菌對陽離子擬肽類小分子（Small Cationic Peptidomimetics）與多種抗生素表現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)的伴隨性敏感現(xiàn)象（Collateral Sensitivity），并且該伴隨性敏感現(xiàn)象主要依賴于其中的一個耐藥突變（mexT）。

最后研究人員證明了陽離子擬態(tài)類小分子通過作用于耐藥菌的外膜從而能夠顯著提高該耐藥菌對抗生素的敏感性，以及陽離子擬態(tài)類小分子與抗生素的聯(lián)用能夠有效地抑制耐藥菌的生長并對耐藥菌有特異高效的殺滅效果。

這項研究首次利用內(nèi)源性I-F型CRISPR系統(tǒng)實現(xiàn)了對多重耐藥菌的基因編輯，由于I-F型CRISPR系統(tǒng)普遍存在于多重耐藥的銅綠假單胞菌中（70%），這將為臨床耐藥菌的研究提供高效、簡便的基因編輯方法和一種原位耐藥性解析的新策略。此外，該研究對臨床多重耐藥菌的耐藥機理進(jìn)行了解析并發(fā)現(xiàn)了該菌對陽離子擬態(tài)類小分子的伴隨性敏感現(xiàn)象。這一新發(fā)現(xiàn)將為解決臨床抗耐藥應(yīng)用提供新的思路和手段。

香港大學(xué)徐澤凌博士和微生物研究所李明副研究員為該文章共同第一作者，閆愛新副教授和向華研究員為共同通訊作者。相關(guān)工作得到國家自然科學(xué)基金和香港大學(xué)等相關(guān)基金的支持。

原文標(biāo)題：

Native CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing Enables Dissecting and Sensitizing Clinical Multidrug-Resistant P. aeruginosa