深圳子科生物報道：一氧化氮（Nitric Oxide, NO）是一種化學(xué)性質(zhì)活潑的氣體，也是一種神奇的信號分子。一氧化氮信號通路在調(diào)節(jié)血管擴張、神經(jīng)傳遞、血小板凝集、免疫、細(xì)胞增殖、線粒體呼吸等生理過程中起著至關(guān)重要的作用。1998年Robert F. Furchgott， Louis J. Ignarro 和 Ferid Murad 由于闡明一氧化氮是一種信號分子而被授予諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

以心血管系統(tǒng)為例，上皮細(xì)胞中的一氧化氮合成酶被上游信號激活后會催化生成一氧化氮。一氧化氮自由擴散至鄰近的血管平滑肌細(xì)胞中，結(jié)合并激活一氧化氮受體——可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC），進(jìn)而催化GTP生成第二信使cGMP。cGMP通過激活下游PKG等效應(yīng)蛋白來發(fā)揮生理功能。作為一氧化氮受體的sGC是利奧西呱（Riociguat，用于治療肺動脈高壓）的作用靶點。此外，硝酸甘油，一種從140年前就應(yīng)用于臨床治療心絞痛的藥物，也是通過釋放一氧化氮來激活sGC而發(fā)揮作用的。

今年是鳥苷酸環(huán)化酶發(fā)現(xiàn)的50周年。1969年，人們首次檢測到鳥苷酸環(huán)化酶的活力，發(fā)現(xiàn)鳥苷酸環(huán)化酶包含兩種形式：膜結(jié)合的鳥苷酸環(huán)化酶和可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）；在上個世紀(jì)80年代，幾個研究組分別從組織中純化出sGC；1988 和1990年，可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的兩個亞基分別被克隆出來。此后的研究證明：sGC是異源二聚體，由一個α亞基和一個β亞基構(gòu)成。α和β亞基的序列具有同源性，而且結(jié)構(gòu)域排布類似：N端的H-NOX結(jié)構(gòu)域，PAS結(jié)構(gòu)域，CC結(jié)構(gòu)域及催化結(jié)構(gòu)域CD。前期研究表明，β亞基的H-NOX結(jié)構(gòu)域結(jié)合了一個亞鐵血紅素，與NO有高親和力。該亞鐵被氧化成三價鐵后酶的活力會降低。雖然此前結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的零碎數(shù)據(jù)對我們理解sGC的機制至關(guān)重要，但一氧化氮是如何激活sGC催化活力的仍然是該領(lǐng)域最大的未解之謎。

北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所，生命科學(xué)聯(lián)合中心陳雷課題組在Nature雜志上發(fā)表題為“Structural insights into the mechanism of human soluble guanylate cyclase”的文章，首次解析了人源sGC在無活力狀態(tài)及一氧化氮激活狀態(tài)下的高分辨冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并結(jié)合突變體活力實驗，提出了sGC的工作機制。文章第一作者為康云路和劉銳。

經(jīng)過同源蛋白篩選等步驟，陳雷研究組確定以人源α1β1亞基組成的sGC蛋白為研究對象。隨后，該研究組制備了四種sGC的冷凍樣品：無配體結(jié)合狀態(tài)；血紅素鐵處于氧化（無活力）狀態(tài)；一氧化氮激活狀態(tài)以及H105C組成型激活突變體。陳雷研究組克服了樣品制備、數(shù)據(jù)處理等困難，通過單顆粒冷凍電鏡技術(shù)獲得了上述四種樣品分別在4?，3.9?，3.8?及6.8?分辨率的電子密度，并根據(jù)Multibody修正后的電子密度及同源蛋白結(jié)構(gòu)搭建了其原子模型。

無配體結(jié)合狀態(tài)和血紅素氧化狀態(tài)的sGC結(jié)構(gòu)非常相近，被歸類于無活力狀態(tài)。一氧化氮激活狀態(tài)和H105C組成型激活突變體sGC結(jié)構(gòu)非常相近，被歸類于激活狀態(tài)。在無活力狀態(tài)下，整個分子出于彎曲狀態(tài)，其結(jié)構(gòu)可以大體分為：H-NOX和PAS結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的感受模塊，CC結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的傳導(dǎo)模塊及催化結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的催化模塊。β1 H105與位于血紅素中央的鐵離子緊密結(jié)合，使β1 H-NOX處于失活構(gòu)象，而α1 H-NOX的血紅素結(jié)合口袋被N端螺旋所占據(jù)，無法結(jié)合血紅素。兩個亞基的H-NOX結(jié)構(gòu)域在空間上由PAS異源二聚體隔開，并不直接接觸。位于整個分子中間的傳導(dǎo)模塊在靠近N端部分有一個近直角的彎曲，這種彎曲的構(gòu)象是由β1 H-NOX與PAS及CC結(jié)構(gòu)域復(fù)雜的相互作用來穩(wěn)定的。在無活力狀態(tài)下，位于C端的催化模塊的底物結(jié)合口袋處于關(guān)閉狀態(tài)，底物無法結(jié)合。二硫鍵交聯(lián)實驗進(jìn)一步驗證了無活力狀態(tài)下所觀測到的結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。

在一氧化氮激活狀態(tài)下，β1 H-NOX的H105 與Heme中鐵離子的相互作用被一氧化氮的結(jié)合破壞，導(dǎo)致β1 H-NOX結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化，并且進(jìn)一步導(dǎo)致β1 H-NOX與周圍結(jié)構(gòu)域的相互作用界面發(fā)生變化，最終，sGC處于一種與無活力狀態(tài)差別很大的伸展?fàn)顟B(tài)。此構(gòu)象中，構(gòu)成傳導(dǎo)模塊的CC結(jié)構(gòu)域從無活力狀態(tài)中的直角彎曲螺旋變成了兩根完整的伸展的螺旋，該構(gòu)象變化類似于膝關(guān)節(jié)的彎曲和伸展。CC結(jié)構(gòu)域兩個螺旋之間還發(fā)生了70度的相對轉(zhuǎn)動，導(dǎo)致與CC結(jié)構(gòu)域直接相連的催化模塊的構(gòu)象變化：兩個亞基的催化結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生了扭轉(zhuǎn)，底物結(jié)合口袋打開，并且在兩個催化結(jié)構(gòu)域之間可以觀察到底物類似物的結(jié)合。

研究人員通過比較無活力和激活兩種狀態(tài)的構(gòu)象，發(fā)現(xiàn)β1 H-NOX的構(gòu)象變化是整個sGC分子結(jié)構(gòu)改變的驅(qū)動力，該構(gòu)象變化通過氨基酸間的相互作用傳遞至整個感受模塊和傳導(dǎo)模塊，最終到達(dá)催化模塊。這些結(jié)構(gòu)上的觀察與本項工作中報道的突變體活力測定結(jié)果相吻合：β1 H-NOX的缺失突變體無法被一氧化氮激活；β1 H-NOX與周圍結(jié)構(gòu)域相互作用界面上的突變體的一氧化氮激活大大減弱；傳導(dǎo)模塊發(fā)生構(gòu)象變化的“關(guān)節(jié)”位置的脯氨酸突變導(dǎo)致一氧化氮無法激活。

綜上所述，這項研究通過強大的結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，觀測到了一氧化氮激活sGC過程中的構(gòu)象變化，為深入理解sGC的工作機制奠定了基礎(chǔ)。

北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)所、生命科學(xué)聯(lián)合中心陳雷實驗室主要研究膜蛋白特別是與代謝類疾病和心血管疾病相關(guān)的重要膜蛋白的結(jié)構(gòu)（http://www.imm.pku.edu.cn/kytd/rcdw/34142.htm）。該實驗室此前解析了與糖尿病和心血管疾病相關(guān)的KATP通道，與腎病相關(guān)的TRPC3/6通道及機械力敏感的atOSCA1通道的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。此文報道的sGC工作是該實驗室在心血管疾病藥物靶點方向的一個分支。陳雷實驗室長期招收博士生，希望志于相關(guān)方向的研究生加入該實驗室。

原文標(biāo)題：

Structural insights into the mechanism of human soluble guanylate cyclase