深圳子科生物報道：東方肝膽外科醫(yī)院王紅陽院士團隊長期從事肝癌的基礎(chǔ)與臨床研究工作。近期，該團隊利用Arraystar Human circRNA 芯片、mRNA表達譜芯片和miRNA表達譜芯片對早期肝癌組織和鄰近正常組織的circRNA, mRNA和miRNA進行了全面的差異表達分析。研究發(fā)現(xiàn)，CircRNA-CDYL（以下稱circ-CDYL）在肝癌早期表達水平顯著上調(diào)，可促進EPCAM陽性的肝癌起始細胞比例上升。Circ-CDYL 通過吸附miR-892a和miR-328-3p，調(diào)節(jié)肝癌來源生長因子HDGF和缺氧誘導(dǎo)因子天冬酰胺羥化酶HIF1AN的表達，形成了以Circ-CDYL為核心的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)， HDGF下游的PI3K-AKT-mTORC1/β-catenin信號通路和HIF1AN下游的NOTCH2信號通路被調(diào)節(jié)，導(dǎo)致致癌蛋白MYC和SURVIVIN表達上調(diào)，從而促進了早期肝癌的發(fā)生發(fā)展進程。干擾Circ-CDYL表達，同時聯(lián)合使用靶向PI3K 和HIF1AN分子的抑制劑wortmannin和NOD，可高效抑制肝癌細胞的生長。臨床樣本分析發(fā)現(xiàn)，Circ-CDYL或Circ-CDYL聯(lián)合HDGF和HIF1AN，均可作為區(qū)分早期肝癌的獨立標志物。該研究發(fā)表在肝臟病學(xué)領(lǐng)域權(quán)威期刊Hepatology（IF:14.079）上（circRNA, mRNA與miRNA芯片實驗均由康成生物提供技術(shù)服務(wù)）。

研究背景
肝癌是一類病情發(fā)展迅速的惡性腫瘤，近年來發(fā)生率和死亡率不斷攀升。由于缺乏有效的早期診斷標志物和治療靶點，許多患者不能被及時發(fā)現(xiàn)和治療，三分之二的肝癌患者確診時已處于中晚期。因此，尋找特異性的診斷標志物和治療靶點顯得十分迫切和必要。目前大部分肝癌研究都集中在肝癌的中晚期階段，而對肝癌早期的情況知之甚少。
越來越多的證據(jù)表明，非編碼RNA在人體中具有廣泛的生理病理作用。circRNA是一類異常穩(wěn)定的非編碼RNA分子，其已知的功能包括吸附miRNA或蛋白，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和剪接過程，以及翻譯短肽，是一種極具潛力的分子標志物和治療靶點。然而，目前大多數(shù)circRNA的分子和生物學(xué)功能處于未知狀態(tài)。

研究思路
作者首先通過Arraystar Human circRNA 芯片、Agilent human mRNA array、Exiqon human microRNA array分析了早期肝癌組織和鄰近正常組織的circRNA，mRNA 和miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)有92個circRNA表達上調(diào)，85個circRNA表達下調(diào)；9470個mRNA表達上調(diào)，10765個mRNA表達下調(diào)；310個miRNA表達上調(diào)，142個miRNA表達下調(diào)。為了進一步研究circRNA，miRNA和mRNA之間的相互作用，作者進行了RNA互作網(wǎng)絡(luò)分析，并基于ceRNA調(diào)控特點，依據(jù)三個標準進行了篩選：1）候選circRNA和mRNA具有共同的miRNA作用元件（MRE）；2）候選circRNA和mRNA在肝癌組織和正常組織中的變化趨勢一致；3）排除由差異表達miRNA所介導(dǎo)的互作網(wǎng)絡(luò)。篩選得到了126個共同上調(diào)的circRNA-mRNA對和74個共同下調(diào)的circRNA-mRNA對。作者最終挑選了在早期肝癌組織中上調(diào)最顯著的Circ-CDYL進行下一步研究，Circ-CDYL 通過吸附miR-892a和miR-328-3p，調(diào)控肝癌來源生長因子HDGF和缺氧誘導(dǎo)因子天冬酰胺羥化酶HIF1AN的表達。隨后作者使用qRT-PCR技術(shù)對Circ-CDYL、HDGF和HIF1AN在肝癌早期組織（0和A期）和肝癌晚期組織（B和C期）進行了驗證，結(jié)果與芯片結(jié)果一致。一代測序結(jié)果證實了Circ-CDYL來源于基因CDYL的2號外顯子，核質(zhì)分離實驗則表明Circ-CDYL在細胞核和細胞漿中均有表達，但主要位于細胞漿中，提示Circ-CDYL可能作為ceRNA發(fā)揮功能。
接下來作者對Circ-CDYL的生理功能進行了探索，體外敲低和過表達實驗表明，Circ-CDYL可促進癌癥細胞增殖（CCK8細胞增殖實驗），提升肝癌啟動細胞(T-ICs)和EPCAM+ T-ICs細胞的比例（FACS），促進腫瘤成球生長（腫瘤成球?qū)嶒灒?，增強癌細胞對化療藥的耐受性（FACS檢測細胞凋亡）和癌癥細胞在小鼠體內(nèi)的成瘤能力（小鼠腫瘤移植模型）。
然后，作者對Circ-CDYL的作用機制進行了探討。lucifearse報告基因?qū)嶒?、miRNA pull-down實驗、結(jié)合位點阻斷實驗證實HDGF和HIF1AN的3’UTR區(qū)分別含有miR-892a作用元件和miR-328-3p作用元件，然而miRNA和靶向mRNA之間不存在負相關(guān)關(guān)系。相反，Pearson相關(guān)性分析、Circ-CDYL敲低和過表達實驗、HDGF和HIF1AN干擾實驗、FISH共定位實驗、結(jié)合位點阻斷實驗結(jié)果表明，Circ-CDYL通過ceRNA機制調(diào)控HDGF和HIF1AN的表達，該機制依賴于miR-892a和miR-328-3p。進一步的下游信號通路研究顯示，Circ-CDYL上調(diào)HDGF 和HIF1AN表達，分別激活PI3K-AKT-mTORC1/β-catenin信號通路和抑制HIF1AN下游的NOTCH2信號通路，增強了致癌蛋白MYC和SURVIVIN表達，從而促進早期肝癌的發(fā)生發(fā)展。
最后，作者探索了Circ-CDYL在肝癌臨床治療和診斷上的潛在應(yīng)用價值。使用PI3K抑制劑wortmannin或者HIF1AN抑制劑NOD處理，可以阻斷由Circ-CDYL引起的MYC和SURVIVIN表達上調(diào)，而且兩種抑制劑聯(lián)合使用效果最佳。并且，如果在使用兩種抑制劑的同時，干擾Circ-CDY表達，可以最大程度的抑制MYC和SURVIVIN表達，有效降低EPCAM+ T-ICs 的比例，實現(xiàn)對肝癌細胞生長和增殖的最佳抑制效果。在肝癌早期診斷方面，ROC分析顯示，Circ-CDYL、HDGF或HIF1AN三個分子分別呈現(xiàn)出良好的靈敏度和特異性，而且三種分子聯(lián)用效果最佳，其靈敏性高達75.36%和特異性高達66.67%。

技術(shù)路線

結(jié)果展示

圖1. Arraystar Human circRNA芯片、mRNA表達譜芯片和miRNA表達譜芯片篩選出了一個在肝癌早期高表達的cirRNA Circ-CDYL以及由Circ-CDYL驅(qū)動的ceRNA網(wǎng)絡(luò), 并通過qRT-PCR和一代測序進行了表達和序列驗證。
 

圖2. Circ-CDYL的功能試驗結(jié)果。Circ-CDYL可促進癌癥細胞增殖（A），提升肝癌啟動細胞(T-ICs)和EPCAM+ T-ICs細胞的比例（B和E），促進腫瘤成球生長（C），增強癌細胞對化療藥的耐受性（D）和癌癥細胞在小鼠體內(nèi)的成瘤能力（F）。

圖3. 干擾Circ-CDYL表達，同時聯(lián)合使用靶向PI3K 和HIF1AN分子的抑制劑wortmannin和NOD，具有抑制肝癌細胞生長的最佳效果。
 圖4.  Circ-CDYL 聯(lián)合 HDGF、HIF1AN分子在早期肝癌診斷上具有極高的靈敏度和特異性。

研究意義
本研究通過Arraystar Human circRNA 芯片、mRNA表達譜芯片和miRNA表達譜芯片篩選出了一個在肝癌早期高表達的cirRNA Circ-CDYL以及由Circ-CDYL驅(qū)動的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。Circ-CDYL 通過吸附miR-892a和miR-328-3p，促進肝癌來源生長因子HDGF和缺氧誘導(dǎo)因子天冬酰胺羥化酶HIF1AN的表達，激活HDGF下游的PI3K-AKT-mTORC1/β-catenin信號通路和抑制HIF1AN下游的NOTCH2信號通路，上調(diào)致癌蛋白MYC和SURVIVIN，從而促進早期肝癌的發(fā)生發(fā)展進程。重要的是，本研究在肝癌早期診斷和治療上提供了極有價值的線索。干擾Circ-CDYL表達，同時聯(lián)合使用靶向PI3K 和HIF1AN分子的抑制劑wortmannin和NOD，可高效抑制肝癌細胞的生長。Circ-CDYL、HDGF和HIF1AN三分子聯(lián)用在診斷早期肝癌上呈現(xiàn)出了極高的靈敏度和特異性。
通訊作者介紹
本文的通訊作者是東方肝膽外科醫(yī)院、國家肝癌科學(xué)中心王紅陽教授。王紅陽教授是我國腫瘤學(xué)、分子生物學(xué)著名專家，是教育部長江特聘教授、中國工程院院士?，F(xiàn)任國家肝癌科學(xué)中心主任、國際合作生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中心主任。中國抗癌協(xié)會副理事長，中國醫(yī)師協(xié)會精準醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會主任委員。王紅陽教授長期從事腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究，對腫瘤的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控、肝癌新分子標志物鑒定及應(yīng)用等有重要建樹。在國際有影響的主流期刊發(fā)表論文200余篇；近五年申報發(fā)明專利28項，已獲授權(quán)12項（國際專利2項），主持研發(fā)的Glypican-3肝癌檢測診斷試劑盒獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）頒發(fā)的三類醫(yī)療器械注冊證（是我國第一個以具有完全自主產(chǎn)權(quán)的單克隆抗體為基礎(chǔ)研發(fā)獲批的試劑盒）。
李亮副研究員為本文共同通訊作者，第一作者是課題組危晏平碩士。在王紅陽院士的帶領(lǐng)下，該課題組長期關(guān)注早期肝癌的診斷及非編碼RNA調(diào)控，相關(guān)系列研究成果發(fā)表在Gut, Hepatology, Cancer letters，F(xiàn)aseb journal等期刊上。

原文鏈接
A Noncoding Regulatory RNAs Network Driven by Circ‐CDYL Acts Specifically in the Early Stages Hepatocellular Carcinoma