深圳子科生物報(bào)道：Sangamo Therapeutics公司的研究人員上周五在《Nature Communications》雜志上發(fā)表題為“Diversifying the Structure of Zinc Finger Nucleases for High-Precision Genome Editing”的文章，展示了其第二代的鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)。

據(jù)Sangamo介紹，這些改進(jìn)使得ZFN的多樣性增加到64倍，從而有望對(duì)特定基因組位點(diǎn)進(jìn)行高度精確的編輯。文章的通訊作者Edward J. Rebar博士是Sangamo的高級(jí)副總裁兼首席技術(shù)官，第一作者是David Paschon博士。

Paschon博士及其同事通過(guò)一系列蛋白質(zhì)改造工作，開發(fā)出新的ZFN結(jié)構(gòu)。這些改造包括顛倒DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸酶結(jié)構(gòu)域的順序，以及運(yùn)用新的接頭（linker）跳過(guò)相鄰鋅指之間的堿基。通過(guò)這種結(jié)構(gòu)多樣化的策略，他們?cè)噲D大幅度提高ZFN的靶向精確度。

（圖片來(lái)自原文，紅色部分為接頭）

研究人員開發(fā)出一系列新接頭，能夠跳過(guò)鋅指-鋅指以及鋅指-FokI切割結(jié)構(gòu)域之間的堿基。他們報(bào)道稱，這些改造使得ZFN結(jié)構(gòu)的數(shù)量增加到64倍，能夠?qū)崿F(xiàn)任意位點(diǎn)的靶向切割。他們還評(píng)估了30種新結(jié)構(gòu)，確定其中97%為活性核酸酶。

“我們的研究表明，我們的接頭元件能夠與現(xiàn)有的鋅指結(jié)合，以接近1.0的密度靶向任意基因組片段，也就是說(shuō)，ZFN能夠靶向幾乎每一個(gè)堿基。同時(shí)我們還表明，這些結(jié)構(gòu)改進(jìn)有望顯著提高ZFN的靶向精確度，”研究人員寫道。

讓ZFN更有吸引力

同為基因編輯技術(shù)，人們不免將ZFN與CRISPR進(jìn)行比較。一直以來(lái)，人們對(duì)ZFN的批評(píng)包括與CRISPR相比成本太高、速度太慢，以及開發(fā)高質(zhì)量基因編輯產(chǎn)品的門檻過(guò)高。為此，Sangamo一直致力于縮短ZFN的開發(fā)周期。

“這種新結(jié)構(gòu)顯著提高了我們的靶向能力，將確保我們能夠靶向最佳序列窗口，實(shí)現(xiàn)治療應(yīng)用。這說(shuō)明了我們ZFN基因組編輯技術(shù)的多功能性，”Rebar博士談道。

“在開發(fā)治療用的核酸酶時(shí)，關(guān)鍵要求是能夠定位臨床效果最佳的雙鏈斷裂。在許多情況下，這一考慮使得最佳切割目標(biāo)只能限制在狹窄的窗口。因此，提高靶向精確度一直是人們長(zhǎng)期關(guān)注的問(wèn)題，”Rebar補(bǔ)充道。

此前一個(gè)月，Sangamo宣布了利用ZFN技術(shù)治療粘多糖貯積癥（MPS）的I/II期臨床試驗(yàn)的中期結(jié)果。盡管研究證實(shí)了療法的安全性以及關(guān)鍵酶的表達(dá)，但沒(méi)有取得公司期望的效果。

“它的確在發(fā)揮作用，但不足以帶來(lái)臨床受益，”Sangamo的CEO Sandy Macrae說(shuō)。這些中期結(jié)果導(dǎo)致Sangamo的股價(jià)大幅下跌，從12.02美元跌至8.31美元，之后才逐漸反彈。

為人們帶來(lái)更多選擇

在這項(xiàng)研究中，Sangamo的研究人員表示，他們開發(fā)出新的接頭，能夠?qū)okI核酸酶結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)域的N端連接，而以往只能與鋅指結(jié)構(gòu)域的C端連接。據(jù)介紹，這種設(shè)計(jì)產(chǎn)生了三種替代的ZFN二聚體，讓設(shè)計(jì)ZFN時(shí)的選擇增加到四倍。

同時(shí)，新的接頭也允許相鄰鋅指之間的堿基跳躍。這樣，經(jīng)過(guò)改造的鋅指就能夠與部分移位的DNA序列相結(jié)合，同時(shí)保留相同的切割位點(diǎn)。如此一來(lái)，人們的設(shè)計(jì)選擇又增加到16倍。

“將這兩項(xiàng)改進(jìn)納入我們的ZFN平臺(tái)，使得在任何目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行有效基因組編輯的ZFN設(shè)計(jì)選項(xiàng)增加到64倍，”研究人員報(bào)告稱。他們表示，這些新型結(jié)構(gòu)在三種治療應(yīng)用中表現(xiàn)出出色的效率、精確度和特異性。

未來(lái)，這種接頭也有望應(yīng)用在TALENs、FokI-dCas9和Cas9等堿基編輯器中，以改善這些系統(tǒng)的性能。

原文檢索

Diversifying the structure of zinc finger nucleases for high-precision genome editing

Nature Communications 10, Article number: 1133 (2019)