深圳子科生物報(bào)道：基因編輯工具的快速發(fā)展令生物學(xué)研究領(lǐng)域著迷，目前第三代DNA剪刀的主角是CRISPR，而2016年新出現(xiàn)的一種新堿基編輯方法：不會引起隨機(jī)的DNA缺失和插入，而是替換一個(gè)DNA基因，也吸引了生物學(xué)家的注意。

這種稱為單堿基編輯的方法是由與CRISPR-Cas9（nCas9，切口酶）變體與另外一種稱為胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase）構(gòu)成，用T代替C，通過導(dǎo)向RNA直接指向正確DNA位置。

單堿基編輯器主要分為兩類，胞嘧啶單堿基編輯器(CBE)與腺嘌呤單堿基編輯器(ABE)，分別由胞嘧啶脫氨酶或改造的腺嘌呤脫氨酶與nCas9蛋白融合而來，對應(yīng)地可在基因組中的靶向位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)C>T或A>G的堿基編輯。目前，CBE與ABE已在多個(gè)物種中得到了廣泛應(yīng)用。

然而，對它們脫靶效應(yīng)的檢測還很不充分，數(shù)據(jù)主要來源于體外實(shí)驗(yàn)研究或者對利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測的有限的靶序列相似位點(diǎn)的檢測，CBE與ABE在體內(nèi)全基因組范圍的脫靶效應(yīng)還未得到評估。

來自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組首次在體內(nèi)利用全基因組測序技術(shù)全面分析和比較了三種單堿基編輯系統(tǒng)在基因組水平上的脫靶效應(yīng)。

他們在植物中對BE3(基于融合rAPOBEC1胞嘧啶脫氨酶的CBE系統(tǒng))，HF1-BE3（高保真版本BE3）與ABE單堿基編輯系統(tǒng)的特異性進(jìn)行了全基因組水平評估，首次在體內(nèi)利用全基因組測序技術(shù)全面分析和比較了這三種單堿基編輯系統(tǒng)在基因組水平上的脫靶效應(yīng)。

這項(xiàng)研究對經(jīng)過不同單堿基編輯系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的56棵T0代水稻植株與21株對照植株進(jìn)行全基因組測序。進(jìn)一步序列統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過單堿基編輯系統(tǒng)處理后，基因組內(nèi)的插入或刪除（indels）突變的數(shù)量與對照組相比沒有顯著變化，但是BE3與HF1-BE3，無論是在有無sgRNA的情況下，均可在水稻基因組中造成大量的單核苷酸變異(SNVs)，且大部分為C>T類型的堿基突變。與經(jīng)過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化但不含任何堿基編輯系統(tǒng)的對照植株相比，BE3系統(tǒng)和HF1-BE3系統(tǒng)處理的植株在基因組范圍內(nèi)的C>T SNVs分別增加了94.5%和231.9%，大約額外產(chǎn)生了98個(gè)C>T SNVs和242個(gè)C>T SNVs。

這項(xiàng)研究表明現(xiàn)有BE3和HF1-BE3系統(tǒng)，而非ABE系統(tǒng)，可在植物體內(nèi)造成難以預(yù)測的脫靶突變，因此，需要進(jìn)一步優(yōu)化提高其特異性。該工作創(chuàng)新性地利用相似遺傳背景的克隆植物及全基因組重測序解決了以前大量異質(zhì)細(xì)胞序列分析的復(fù)雜性。

此外，中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所、上海腦科學(xué)與類腦研究中心與計(jì)算生物學(xué)研究所等處合作，建立了一種被命名為GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）的新型脫靶檢測技術(shù)，為基因編輯工具的安全性評估帶來了突破性的新工具，有望成為新的行業(yè)檢測標(biāo)準(zhǔn)。

這項(xiàng)研究與上述研究均發(fā)表在3月1日的Science雜志上，本文通訊作者為中科院神經(jīng)所楊輝研究員, 計(jì)算生物學(xué)所李亦學(xué)研究員，斯坦福大學(xué)Lars M. Steinmetz教授。

要提升檢測脫靶效應(yīng)的精度，就必須徹底顛覆原有的脫靶檢測手段。首先，為了實(shí)現(xiàn)不借助于脫靶位點(diǎn)預(yù)測，這就要求必須找到非常嚴(yán)格的對照組來確定基因突變的位點(diǎn)；同時(shí)為了檢測不依賴于sgRNA的隨機(jī)突變，最好使用基于單細(xì)胞全基因組測序。

為了實(shí)現(xiàn)以上目標(biāo)，楊輝研究組與合作者建立了一種名叫“GOTI”的脫靶檢測技術(shù)。研究者們在小鼠受精卵分裂到二細(xì)胞期的時(shí)候，編輯一個(gè)卵裂球，并使用紅色熒光蛋白將其標(biāo)記。小鼠胚胎發(fā)育到14.5天時(shí)，將整個(gè)小鼠胚胎消化成為單細(xì)胞，利用流式細(xì)胞分選技術(shù)基于紅色熒光蛋白，分選出基因編輯細(xì)胞和沒有基因編輯細(xì)胞，再進(jìn)行全基因組測序比較兩組差異。這樣就避免了單細(xì)胞體外擴(kuò)增帶來的噪音問題。而且由于實(shí)驗(yàn)組和對照組來自同一枚受精卵，理論上基因背景完全一致，因此直接比對兩組細(xì)胞的基因組，其中的差異基本就可以認(rèn)為是基因編輯工具造成的。

在楊輝實(shí)驗(yàn)室全體成員與合作單位的共同努力下，GOTI系統(tǒng)被成功建立了起來。借助于這個(gè)系統(tǒng)，團(tuán)隊(duì)成員先是檢測了最經(jīng)典的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，設(shè)計(jì)良好的CRISPR/Cas9并沒有明顯的脫靶效應(yīng)，這個(gè)結(jié)果結(jié)束了之前對于CRISPR/Cas9脫靶率的爭議。然而團(tuán)隊(duì)還檢測了另一個(gè)同樣被給予厚望的CRISPR/Cas9衍生技術(shù)BE3，這個(gè)系統(tǒng)可以精確引入點(diǎn)突變，在之前的研究中從未發(fā)現(xiàn)過有明顯的脫靶問題。

然而在GOTI的檢測下發(fā)現(xiàn)，BE3存在非常嚴(yán)重的脫靶，而且這些脫靶大多出現(xiàn)在傳統(tǒng)脫靶預(yù)測認(rèn)為不太可能出現(xiàn)脫靶的位點(diǎn)，因此之前方法一直沒有發(fā)現(xiàn)其脫靶問題。團(tuán)隊(duì)分析后認(rèn)為，這些脫靶位點(diǎn)有部分出現(xiàn)在抑癌基因上，因此經(jīng)典版本的BE3有著很大的隱患，目前不適合作為臨床技術(shù)。研究團(tuán)隊(duì)的這些重要發(fā)現(xiàn)，證實(shí)了以BE3為代表的部分基因編輯技術(shù)存在無法預(yù)測的脫靶風(fēng)險(xiǎn)，讓世人重新審視了這些新興技術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)。

更重要的是，此工作建立了一種在精度、廣度和準(zhǔn)確性上遠(yuǎn)超越之前的基因編輯脫靶檢測技術(shù)，有望由此開發(fā)精度更高、安全性更大的新一代基因編輯工具，建立行業(yè)的新標(biāo)準(zhǔn)。

原文標(biāo)題：

Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos

Cytosine, But not Adenine, Base Editors Induce Genome-wide Off-target Mutations in Rice