深圳子科生物報(bào)道：杜克大學(xué)的研究人員表示，使用CRISPR基因組編輯技術(shù)進(jìn)行單一系統(tǒng)治療可以安全、穩(wěn)定地糾正小鼠遺傳疾病——杜氏肌營養(yǎng)不良（DMD），他們?cè)?月18日的《Nature Medicine》發(fā)表文章。

2016年杜克大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程副教授Charles Gersbach發(fā)表了首次利用CRISPR成功治療遺傳疾病動(dòng)物模型的策略之一，該策略有可能轉(zhuǎn)化為人類療法。此后，許多其他例子逐漸發(fā)表，一些針對(duì)人類疾病的基因組編輯療法目前也正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

Gersbach的最新研究集中在一個(gè)DMD小鼠模型上，該模型因機(jī)體無法產(chǎn)生抗肌萎縮蛋白（dystrophin），這種長蛋白鏈將肌肉纖維內(nèi)部與周圍支持結(jié)構(gòu)結(jié)合起來。

抗肌萎縮蛋白由一個(gè)包含了79個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)的基因編碼，基因編碼區(qū)被稱為外顯子，如果一個(gè)或多個(gè)外顯子被遺傳突變或刪除，鏈就無法建立，導(dǎo)致肌肉緩慢地碎裂和退化。大多數(shù)病人都是10歲左右的輪椅依賴者，而他們的壽命通常不超過20歲或30歲出頭。

Gersbach實(shí)驗(yàn)室的方法是使用CRISPR/Cas9減除基因突變周圍的抗肌萎縮蛋白外顯子，讓身體天然DNA修復(fù)系統(tǒng)將剩余的基因重新縫合在一起，從而產(chǎn)生一個(gè)縮短但功能正常的抗肌萎縮蛋白版本。

“隨著我們繼續(xù)致力于開發(fā)基于CRISPR基因療法，測試評(píng)估這一方法的各個(gè)方面迫在眉睫，”Gersbach說?！拔覀儗?shí)驗(yàn)的一個(gè)目標(biāo)是測試該領(lǐng)域的部分討論想法，包括監(jiān)測面對(duì)細(xì)菌Cas9蛋白的潛在免疫反應(yīng)和長期持久性。”

之前為期8周的觀察研究顯示功能性抗肌萎縮蛋白恢復(fù)，肌肉力量增加，然而并未探索治療的長期耐久性。

“人們普遍認(rèn)為基因編輯會(huì)導(dǎo)致永久性的基因矯正，”Gersbach說?！爸匾氖翘剿骺赡芷茐幕蚓庉嬓Ч目赡苄裕缡ケ恢委熂?xì)胞或免疫反應(yīng)?！?

這項(xiàng)新研究的目的就是探索能夠改變基于CRISPR/Cas9的基因編輯長效性的因素。

博后研究員Christopher Nelson對(duì)攜帶缺陷抗肌萎縮蛋白基因的成年和新生小鼠分別進(jìn)行了單劑量的CRISPR治療，在接下來的一年里，研究人員測量了多少肌肉細(xì)胞被成功編輯，發(fā)生了什么類型的基因改變，以及對(duì)細(xì)菌CRISPR蛋白，Cas9，產(chǎn)生的任何免疫反應(yīng)。

其他研究報(bào)告指出，小鼠免疫系統(tǒng)可以對(duì)Cas9產(chǎn)生反應(yīng)，這可能會(huì)干擾CRISPR療法的益處。一些研究小組還報(bào)告說，有些人對(duì)Cas9蛋白有預(yù)先存在的免疫力，可能是因?yàn)橐郧敖佑|過細(xì)菌宿主。

“好消息是，盡管我們觀察到Cas9對(duì)抗體和T細(xì)胞的反應(yīng)，但這兩種反應(yīng)似乎都不會(huì)對(duì)小鼠產(chǎn)生任何毒性，”Nelson說?！斑@種反應(yīng)也沒有阻止抗肌萎縮蛋白的成功基因編輯和長期蛋白表達(dá)能力?！?

研究結(jié)果提出了應(yīng)對(duì)未來挑戰(zhàn)的可能方法。例如，只有2天大的小鼠，免疫系統(tǒng)沒有完全發(fā)育，因此未檢測到免疫反應(yīng)，CRISPR基因組編輯系統(tǒng)不僅保持穩(wěn)定，在某些情況下，甚至在一年內(nèi)得到了加強(qiáng)。可以暢想一下，將這種療法提供給嬰兒的也許是一種規(guī)避或調(diào)節(jié)不良免疫反應(yīng)的方法。

然而，Gersbach和Nelson承認(rèn)，老鼠的免疫系統(tǒng)通常與人類的截然不同。目前，DMD新生兒篩查還沒有廣泛開展，多數(shù)杜氏患兒診斷年齡在3至5歲。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，Gersbach說，在治療過程中不排除需要抑制免疫系統(tǒng)。

研究人員還在調(diào)查限制Cas9在短時(shí)間內(nèi)僅表達(dá)或傳遞給肌肉細(xì)胞的潛在策略，這一招也許能逃避免疫檢測。

“所有小鼠在治療后1年都表現(xiàn)良好，隨著我們向大型動(dòng)物模型邁進(jìn)，仍需更多地關(guān)注免疫反應(yīng)?！?

Nelson和Gersbach之前曾討論過CRISPR/Cas9的非目標(biāo)編輯的可能性（脫靶），這篇報(bào)道指出可能的脫靶位點(diǎn)活性很小。但是最近其他研究報(bào)告稱，CRISPR有時(shí)會(huì)在正確的位置但以不正確的方式進(jìn)行基因編輯，例如，一些研究表明，CRISPR可切割比預(yù)期大得多的基因片段，或者DNA片段嵌入到切割處。這些類型的編輯以前在基因組編輯研究中都不曾報(bào)道，因?yàn)槭褂玫姆椒ㄖ徊捎妙A(yù)期編輯。

為了全面地映射所有編輯，Nelson使用了一種DNA測序方法，不帶目的性地如實(shí)報(bào)告任何類型編輯。令人驚訝的是，除了預(yù)期去除的靶外顯子，小鼠體內(nèi)還進(jìn)行了許多類型編輯，包括病毒載體DNA序列的高水平插入。

根據(jù)組織類型和CRISPR劑量，多達(dá)一半的靶編輯造就了這些交替序列的改變。盡管結(jié)果有些吃驚，但這些“無意義”的序列變化似乎并不會(huì)影響CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)DMD的安全性或有效性。

“在這種情況下，因?yàn)榭辜∥s蛋白已經(jīng)有缺陷了，才導(dǎo)致這些編輯不一定引起關(guān)注，”Nelson說?！暗?，任何意想不到的結(jié)果都可能降低你正努力實(shí)現(xiàn)的基因編輯效率，這強(qiáng)調(diào)了客觀識(shí)別的設(shè)計(jì)方式和替換編輯在未來研究中的重要性。”

“以前的研究表明，可能存在其他類型編輯，”Gersbach說?！岸覀兊谝淮问褂弥委熛嚓P(guān)方法對(duì)動(dòng)物模型中的這些事件進(jìn)行了全面測量，在前進(jìn)的道路上，使這一現(xiàn)象得到了進(jìn)一步監(jiān)控和理解?！?

原文檢索：Long-term evaluation of AAV-CRISPR genome editing for Duchenne muscular dystrophy