深圳子科生物報道：2018年12月31日和2019年1月10日，施一公教授領導的研究團隊花開兩朵，分別于《自然》（Nature）和《科學》（Science）報道了《人源γ-分泌酶識別底物Notch的結構機制》（Structural basis of Notch recognition by human γ-secretase）以及《人源γ-分泌酶底物淀粉樣前體蛋白的識別》（Recognition of amyloid precursor protein by human γ-secretase）的文章，分別報道了分辨率為2.7埃的人體γ-分泌酶結合底物Notch以及分辨率為2.6埃的γ-分泌酶結合淀粉樣前體蛋白（APP）的冷凍電鏡結構。文章報道了結合兩種不同底物后γ-分泌酶發(fā)生的構象變化，并對這些構象變化的功能進行了生化研究。上述兩篇報道為理解γ-分泌酶特異性識別并切割底物的分子機制提供了重要基礎，并為研究與癌癥以及阿爾茲海默癥相關的藥物提供了重要的結構信息。

阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease, AD）是當今世界面臨的最為嚴峻的神經(jīng)退行性疾病。臨床表現(xiàn)為腦組織切片中出現(xiàn)淀粉樣斑塊，神經(jīng)元死亡，認知和記憶能力受損，最后腦功能嚴重受損直至死亡。統(tǒng)計結果表明，在65歲以上人群中，其發(fā)病率高達10%，在85歲以上人群中，發(fā)病率更是達到30-50%；我國目前患該病的人口高達500萬，約占世界患者總數(shù)的四分之一，并且由于世界范圍內(nèi)預防治療手段不足，缺乏特效藥物，該疾病有發(fā)病年齡提前，發(fā)病人數(shù)增加的趨勢，給病人及家屬造成極大痛苦，也同時為社會帶來沉重負擔。

阿爾茲海默癥的發(fā)病機理尚不明確。病人腦組織中的淀粉樣斑塊由淀粉樣蛋白前體蛋白（APP, amyloid precursor protein）被酶切割產(chǎn)生的短肽聚集而來。在此切割過程中，最關鍵的蛋白酶是γ-分泌酶（γ-secretase）。γ-分泌酶由四個跨膜蛋白亞基組成，分別為Presenilin（PS1）、Pen-2、Aph-1和Nicastrin。其中，編碼PS1蛋白的基因中有200多個突變與AD病人相關，而PS1正是行使酶切功能的關鍵活性亞基。這些突變有可能導致PS1功能異常而引起阿爾茲海默癥的發(fā)生。γ-分泌酶在阿爾茲海默癥的發(fā)病中扮演著重要角色，很多藥物的研發(fā)直接以γ-分泌酶作為靶點，希望通過調(diào)節(jié)其活性來治療疾病。此外，除淀粉樣蛋白外，重要的信號蛋白Notch也是γ-分泌酶的底物。Notch的異常切割會導致發(fā)育的異常，與一些諸如T細胞急性淋巴細胞白血病在內(nèi)的癌癥發(fā)病也有重要聯(lián)系。作為與阿爾茲海默癥和癌癥均緊密相關的蛋白，γ-分泌酶結構的解析與功能的研究一直是重要的科學問題。

施一公教授2006年在清華大學建設實驗室之初，就將揭示阿爾茲海默癥的發(fā)病機理作為重點研究方向，其中一個主要環(huán)節(jié)是解析γ-分泌酶的高分辨率結構，揭示Presenilin突變體的致病機理。他們經(jīng)過長期不懈的努力，積累了大量經(jīng)驗教訓，先后于近幾年取得一系列重要突破（相關論文請見文末）。此次兩篇文章報道的研究成果是此前施一公研究組對γ-分泌酶結構與功能系統(tǒng)研究不斷深入的延續(xù)。如前文所述，盡管施一公研究組已經(jīng)解析了γ-分泌酶的高分辨率結構，但其如何與底物結合尚不清楚。近年來，多種旨在減少淀粉樣沉淀的γ-分泌酶活性抑制劑的臨床實驗均宣告失敗，較為著名的是禮來公司臨床實驗的Semagacestat。這一抑制劑雖然能夠減少淀粉樣沉淀，但并不能改善患者的認知狀況，更嚴重的是由于同時抑制了γ-分泌酶對Notch的切割，使得患者罹患癌癥的風險大幅增加，最終該臨床實驗提前終止。究其原因，對γ-分泌酶結合底物機制研究的缺失是造成這一失敗的原因之一?；诖?，獲得γ-分泌酶與底物Notch以及APP復合物的結構，對研究γ-分泌酶的底物識別酶切機理，和以γ-分泌酶為靶標的特異性藥物設計具有極大科學意義和潛在應用價值。

由于酶與底物的結合-酶切-解離的過程是高度動態(tài)的過程，獲得酶與底物的復合物結構難度非常大，而γ-分泌酶與其底物都是跨膜蛋白，獲得它們的穩(wěn)定復合物是世界級難題。施一公課題組通過嚴謹?shù)脑O計和篩選，通過半胱氨酸交聯(lián)的辦法，首先成功獲得了γ-分泌酶與底物Notch的穩(wěn)定復合物。通過收集冷凍電鏡的數(shù)據(jù)，他們解析了γ-分泌酶與底物Notch的復合物結構，分辨率高達2.7？，是第一個γ-分泌酶與底物復合物的高分辨率結構，也是第一個膜內(nèi)蛋白水解酶與底物的復合物結構。之后他們基于不同底物蛋白質(zhì)序列及結構比對，利用相似的策略，順利獲得了γ-分泌酶與另一個重要底物底物APP的穩(wěn)定復合物，并獲得了其冷凍電鏡結構。

γ-分泌酶與底物復合物的結構中，催化亞基PS1發(fā)生了較大的構象變化。尤為值得一提的是，在跨膜區(qū)靠近細胞內(nèi)的一側，PS1通過構象變化，與底物的胞內(nèi)段形成穩(wěn)定的β-sheet結構，為穩(wěn)定底物提供了保證。在此狀態(tài)下，底物的跨膜螺旋發(fā)生解旋，暴露出被酶切的位點。這一結構觀察第一次直觀證明了長久以來膜內(nèi)蛋白水解酶酶切底物時，底物蛋白需要發(fā)生解旋的猜想。隨后科研人員通過生物化學的手段，驗證了觀察到的構象變化在酶切底物中的作用。根據(jù)得到的結構，研究組提出了γ-分泌酶結合底物并依次進行多步酶切的機理：底物的跨膜螺旋隨著切割的進行逐步解旋，并與γ-分泌酶形成新的中間態(tài)復合物再次進行切割。此外，文章還討論了底物進入γ-分泌酶活性中心的路徑。在后續(xù)解析的γ-分泌酶與底物APP穿膜區(qū)的復合物結構中，研究者同樣發(fā)現(xiàn)了前文中描述的特征結構：β-sheet和底物在酶切處的解旋。對于潛在的藥物研發(fā)來說，研發(fā)可以特異地抑制APP的切割而不影響Notch切割的藥物，對于治療阿爾茲海默癥且不導致癌癥等副作用具有重大價值。對于某些類的癌癥的藥物研發(fā)亦是如此。研究組通過系統(tǒng)性地在結構當中比較Notch與APP穿膜區(qū)片段的表面特征揭示了研發(fā)這種特異性抑制劑的潛在的結合位點。有很多與阿爾茲海默癥相關的突變集中在γ-分泌酶的活性亞基PS1和底物APP上，其中有一些位點是同一位點突變?yōu)槎鄠€氨基酸的，該研究中通過對結構的詳細分析，發(fā)現(xiàn)這些對應的反復突變大多集中于γ-分泌酶與APP相互作用界面上，文章還據(jù)此分類討論了這些突變可能影響底物結合的機理。

清華大學生命學院、結構生物學高精尖創(chuàng)新中心施一公教授是兩篇研究論文的通訊作者。生命學院博士后、結構生物學高精尖創(chuàng)新中心卓越學者楊光輝、周瑞為兩篇論文的共同第一作者。原清華大學生命學院副研究員周強博士，清華大學生命學院一年級博士生郭雪飛參與了這兩項研究，清華大學冷凍電鏡平臺的雷建林博士對數(shù)據(jù)收集進行了指導。清華大學生命學院博士后、結構生物學高精尖創(chuàng)新中心卓越學者閆創(chuàng)業(yè)以及生命學院柯檬博士參與《自然》雜志相關報道的研究。國家蛋白質(zhì)科學中心（北京）清華大學冷凍電鏡平臺和清華大學高性能計算平臺分別為該研究的數(shù)據(jù)收集和數(shù)據(jù)處理提供了支持，冷凍電鏡平臺的李曉敏對數(shù)據(jù)收集提供了幫助。北京市結構生物學高精尖創(chuàng)新中心（清華）、生命科學聯(lián)合中心（清華大學）、科技部和基金委為該研究提供了經(jīng)費支持。

圖1： γ-分泌酶結合Notch復合物的冷凍電鏡結構。a. γ-分泌酶結合Notch復合物的密度圖。其中橙色標記的為結合的Notch；b. γ-分泌酶結合Notch復合物結構模型；c. 底物結合與不結合狀態(tài)下催化亞基PS1的結構比較，灰白色為未結合底物的狀態(tài)，青色和藍色為結合底物的狀態(tài)，藍色部分為發(fā)生變化的主要區(qū)域； d. PS1與底物跨膜區(qū)靠近細胞膜一側形成β折疊片，從而穩(wěn)定結合底物；e-f. 與γ-分泌酶結合后底物Notch發(fā)生的構象變化。橙色為結合在γ-分泌酶中的Notch構象，灰白色為未結合的構象。

圖2：γ-分泌酶結合APP復合物的冷凍電鏡結構。a. γ-分泌酶結合APP復合物結構模型；b. PS1與底物APP所形成的β折疊片結構，其中一個來源于底物，另外兩個片層來源于PS1；c. APP與Notch跨膜區(qū)結合γ-分泌酶狀態(tài)下表面特征比較，可以觀察到兩種底物的具體區(qū)別；d. APP與γ-分泌酶催化亞基PS1跨膜區(qū)中部分與阿爾茲海默癥相關突變分布。

相關論文：

1. X. Li et al., Structure of a presenilin family intramembrane aspartate protease.Nature 493, 56, (2013)

2. P. Lu et al., Three-dimensional structure of human γ-secretase. Nature 512, 166, (2014)

3. T. Xie et al., Crystal structure of the γ-secretase component nicastrin. PNAS 111(37) , (2014)

4. S. Dang et al., Cleavage of amyloid precursor protein by an archaeal presenilin homologue PSH. PNAS 112 (11) , (2015)

5. L. Sun et al., Structural basis of human γ-secretase assembly. PNAS 112 (19) , (2015)

6. X. Bai et al., An atomic structure of human γ-secretase. Nature 525, 212, (2015)

7. L. Sun et al., Analysis of 138 pathogenic mutations in presenilin-1 on the in vitro production of Aβ42 and Aβ40 peptides by γ-secretase. PNAS 114 (4) , (2017)

8. R. Zhou et al., Dominant negative effect of the loss-of-function γ-secretase mutants on the wild-type enzyme through heterooligomerization. PNAS 114 (48) , (2017)