深圳子科生物報(bào)道：

蛙皮素，又稱為鈴蟾肽，韓蛙皮素，是從蛙皮中分離的一種14個(gè)氨基酸的多肽，研究發(fā)現(xiàn)蛙皮素受體3（BRS3）作為一種G蛋白偶聯(lián)受體，可以調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)和心率。

來自美國NIH美國國家糖尿病、消化及腎臟疾病研究所（NIDDK）的研究人員發(fā)表了題為“Brs3 neurons in the mouse dorsomedial hypothalamus regulate body temperature, energy expenditure, and heart rate, but not food intake”的文章，發(fā)現(xiàn)背內(nèi)側(cè)下丘腦（DMH^Brs3）中表達(dá)Brs3的神經(jīng)元一旦突然激活就會(huì)導(dǎo)致體溫，棕色脂肪組織溫度，能量消耗，心率和血壓的增加，從而指出Brs3表達(dá)是一種測量能量代謝調(diào)節(jié)環(huán)路的潛力標(biāo)記。

這一研究成果公布在Nature Neuroscience雜志上，由Marc Reitman等人領(lǐng)導(dǎo)完成。

背景

BRS3是一種孤兒G蛋白偶聯(lián)受體，具有良好的保守性，在特定的大腦區(qū)域上大量表達(dá)。這種受體所在的G蛋白偶聯(lián)受體 A家族包括有神經(jīng)介素B和胃泌素釋放肽受體。哺乳動(dòng)物BRS3缺乏已知的內(nèi)源性高親和力配體，并且對(duì)蛙皮素具有低親和力，蛙皮素在哺乳動(dòng)物中尚未發(fā)現(xiàn)。

小鼠靶向敲除Brs3會(huì)導(dǎo)致肥胖，這其中涉及能量消耗減少，食物攝入量增加，靜息Tb和靜息心率降低等。一般認(rèn)為，BRS3激動(dòng)劑能增加靜息Tb，能量消耗，心率和血壓，活性棕色脂肪組織（BAT），減少食物攝入量，目前關(guān)于Brs3神經(jīng)元群體的位置和指導(dǎo)這種生理學(xué)的特定環(huán)路仍有待探索。

BRS3存在于腦核中，大部分位于下丘腦中。表達(dá)Brs3與Tb，能量消耗和食物攝入的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，因此可以作為治療代謝性疾病重要環(huán)路的潛力標(biāo)記。

研究結(jié)果

1.Brs3表達(dá)模式

為了研究表達(dá)Brs3的細(xì)胞的功能，研究人員將他莫昔芬誘導(dǎo)Cre重組酶基因靶標(biāo)插入天然Brs3基因座中，構(gòu)建了Brs3-2A-CreERT2（Brs3-Cre）小鼠（圖1）。同時(shí)他們也采用了Cre依賴性tdTomato報(bào)道系（Ai14）使Brs3-Cre表達(dá)可視化。POA，PVH，DMH，紋狀體末端（BNST），內(nèi)側(cè)后背杏仁核和外側(cè)臂旁核的床核tdTomato +神經(jīng)元的濃度最高（圖1和表1）。而對(duì)照組，沒有他莫昔芬治療的則未觀察到tdTomato發(fā)表達(dá)。

原位雜交證明，表達(dá)Brs3 mRNA的大多數(shù)神經(jīng)元也表達(dá)tdTomato mRNA，反之亦然（圖1）。tdTomato表達(dá)模式與之前報(bào)道的Brs3 mRNA和配體結(jié)合一致。由此研究人員得出結(jié)論：Brs3-Cre小鼠中的Cre表達(dá)忠實(shí)地再現(xiàn)了內(nèi)源性Brs3表達(dá)模式。

（圖1）

Brs3定位于X染色體上，Brs3Cre會(huì)發(fā)生X-inactivation，因此這項(xiàng)研究所有后續(xù)研究都使用雄性小鼠。接下來研究人員分析了攜帶Brs3Cre等位基因的小鼠表型。下丘腦Brs3 mRNA表達(dá)降低41±3％（圖2），與同窩對(duì)照相比，Brs3-Cre小鼠的體重，食物攝入，脂肪量和體重略有增加。這一表型表明Brs3Cre等位基因具有降低的BRS3功能。然而，Brs3-Cre小鼠確實(shí)通過增加Tb和減少食物攝入來響應(yīng)選擇性BRS3激動(dòng)劑MK-5046（圖2）。 總之，這些數(shù)據(jù)表明Brs3Cre等位基因?qū)儆趤?效)等位基因，而不是無效突變。

2.通過冷暴露，再喂食和瘦素治療激活Brs3神經(jīng)元

研究人員分析了Brs3神經(jīng)元對(duì)影響能量穩(wěn)態(tài)的干預(yù)措施的反應(yīng)激活。結(jié)果顯示冷暴露刺激了dDMH-DHA，內(nèi)側(cè)視前區(qū)（MPA）和中位前區(qū)（MnPO）的Brs3神經(jīng)元中的c-Fos表達(dá)，但不影響PVH，腹側(cè)DMH（vDMH）或PBN（圖2）。圖1A，b）。相反，在PVH（PVHBrs3神經(jīng)元）和PBN中的Brs3神經(jīng)元中快速增加的c-Fos表達(dá)后重新進(jìn)食，但在dDMH-DHA，vDMH，MPA或MnPO中沒有（圖1）。因此，通過冷暴露和重新進(jìn)食激活Brs3神經(jīng)元的不同亞組。

Brs3 mRNA富含表達(dá)瘦素受體的神經(jīng)元，因此研究人員分析了瘦素是否激活Brs3神經(jīng)元。瘦素處理增加了MPA，MnPO，dDMH-DHA和vDMH中Brs3神經(jīng)元中的STAT3磷酸化，但不增加PVH或PBN（補(bǔ)充圖3a，b），表明這些神經(jīng)元可能被瘦素激活，可能是直接激活。

（圖2）

3.DMH^Brs3神經(jīng)元的光遺傳激活增加Tb，心率和血壓

DMH^Brs3神經(jīng)元的光遺傳激活能幫助科學(xué)家們?cè)诓惶幚硇∈蟮那闆r下研究快速的生理反應(yīng)，這尤其適合復(fù)合檢測心率和血壓。

研究人員用AAV-Flex-ChR2-tdTomato（圖4）和對(duì)照（AAV-DIO-mCherry）病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)DMHBrs3神經(jīng)元，在離體切片實(shí)驗(yàn)中刺激DMH^Brs3神經(jīng)元中的通道視紫紅質(zhì)-2（ChR2）增加神經(jīng)元放電（圖7）。并且研究人員對(duì)清醒小鼠進(jìn)行了五個(gè)周期的研究，其中包括20分鐘的光刺激，然后在激光關(guān)閉的情況下60分鐘（圖4）。

結(jié)果顯示光刺激引發(fā)Tb快速強(qiáng)勁的增加，沒有對(duì)身體活動(dòng)產(chǎn)生影響。在mCherry +對(duì)照小鼠中未觀察到對(duì)應(yīng)變化。增加刺激頻率產(chǎn)生Tb的劑量依賴性增加（補(bǔ)充圖7）。研究人員的標(biāo)準(zhǔn)刺激使用1秒ON，3秒OFF協(xié)議（20 Hz，10毫秒脈沖）。將光劑量加倍（1秒ON，1秒OFF）使Tb的初始增加率加倍（圖7）。因此，這一標(biāo)準(zhǔn)刺激方案不是最大刺激。

導(dǎo)致Tb增加的主要效應(yīng)機(jī)制是棕色脂肪組織的交感神經(jīng)活化，以及血管收縮和行為適應(yīng)。為了研究DMHBrs3光遺傳激活對(duì)BAT熱原的影響，研究人員使用了紅外成像。在基線時(shí)，TBAT為35.7±0.08℃，腰椎溫度（Tlumbar）為34.6±0.09℃。DMH^Brs3神經(jīng)元的光遺傳學(xué)刺激使TBAT增加1.36±0.16℃（P = 6.8×10-5）和Tlumbar為1.24±0.15℃（P = 8.9×10-5;圖4和圖7）。TBAT最初比Tlumbar快1.90±0.18倍。這些結(jié)果表明BAT是Tb增加的驅(qū)動(dòng)因素。

（圖4）

4.DMH^Brs3→RPa途徑增加Tb并接收來自POA和其他核的輸入

研究人員利用AAV-DIO-synaptophysin-mCherry追蹤了DMH^Brs3神經(jīng)元。他們發(fā)現(xiàn)DMH^Brs3神經(jīng)元投射到腹外側(cè)導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（vlPAG），伏隔核，藍(lán)斑和尾部但不是延髓頭端腹外側(cè)區(qū)。其他不太密集的受神經(jīng)支配的大腦區(qū)域包括BNST，丘腦的室旁核和弓狀核（?。?。對(duì)RPa的DMH投射可刺激BAT，研究人員通過用AAV-Flex-ChR2感染DMH細(xì)胞體，并對(duì)RPa進(jìn)行光刺激來測試DMH^Brs3→RPa投射增加Tb的能力。

結(jié)果顯示，刺激DMH^Brs3→RPa末端使Tb增加0.43±0.12℃（P = 0.006），對(duì)體力活動(dòng)沒有影響，并且對(duì)mCherry對(duì)照中的Tb或活性沒有影響（圖5）。因此，選擇性激活DMH^Brs3→RPa途徑足以增加Tb，最有可能通過谷氨酸能預(yù)測。實(shí)際上，DMH^Brs3→RPa神經(jīng)元很少表達(dá)Gad2（2.6±0.5％），這是位于后弧的標(biāo)記（尾至前囟-2.06 mm）。在髓質(zhì)中，研究人員在孤束核和延髓頭端腹外側(cè)區(qū)中稀疏的GFP神經(jīng)元。為了評(píng)估從視前區(qū)到DMH^Brs3→RPa神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)輸入，研究人員進(jìn)行了ChR2輔助電路映射。他們用AAV-ChR2-EYFP轉(zhuǎn)染POA神經(jīng)元，并使用注射在RPa中的HSV-lsl-mCherry識(shí)別DMH^Brs3→RPa神經(jīng)元。自此，研究人員發(fā)現(xiàn)記錄的大多數(shù)DMH^Brs3→RPa神經(jīng)元接受來自POA的GABA能和谷氨酸能輸入（圖7）。這表明DMH^Brs3→RPa電路受到POA的動(dòng)態(tài)調(diào)控。

（圖7）

結(jié)論

遺傳和藥理實(shí)驗(yàn)證明了BRS3在控制Tb，能量消耗，食物攝入和心率方面的作用。研究人員分析了其中起作用的神經(jīng)元，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMH^Brs3神經(jīng)元調(diào)節(jié)Tb，能量支出和心率，同時(shí)不影響食物攝入或身體活動(dòng)。更具體地說，DMH^Brs3神經(jīng)元通過DMH^Brs3→RPa途徑雙向控制Tb，包括對(duì)BAT的作用。相反，PVH^Brs3神經(jīng)元控制食物攝入，不影響Tb，能量消耗或身體活動(dòng)。

這些結(jié)果指出了Brs3敲除小鼠表型的機(jī)制基礎(chǔ)。DMH^Brs3神經(jīng)元失去BRS3可以有助于減少靜息Tb，能量消耗和心率。PVH^Brs3神經(jīng)元中BRS3的缺失可促進(jìn)食物攝入量的增加?？傊?，這些機(jī)制有助于解釋全球泛濫的肥胖問題。

盡管這個(gè)模型很簡單，但需要注意的是遺傳Brs3消融僅消除一種受體，而光遺傳學(xué)和化學(xué)操作操作探測表達(dá)該受體的神經(jīng)元的特性。目前的研究并沒有解決BRS3在神經(jīng)元中的作用。

其他方面也可能有助于調(diào)節(jié)Tb，能量消耗，心率和食物攝入量。例如，研究人員觀察到PBN^Brs3神經(jīng)元在再喂食期間被激活，這可能表明其在調(diào)節(jié)食物攝入或信號(hào)營養(yǎng)狀態(tài)中的作用。類似地，冷環(huán)境激活MPA^Brs3和MnPO^Brs3神經(jīng)元表明這些類型都有助于調(diào)節(jié)產(chǎn)熱。

研究數(shù)據(jù)表明DMH^Brs3→RPa神經(jīng)元受GABA能和谷氨酸能視前神經(jīng)元的調(diào)節(jié)。這還需要進(jìn)一步的研究來確定哪些POA神經(jīng)元為DMH^Brs3→RPa神經(jīng)元提供抑制和興奮性輸入?？傊?，這些研究已經(jīng)確定了兩個(gè)具有單獨(dú)功能的Brs3種群：PVH^Brs3神經(jīng)元可以在不影響Tb的情況下穩(wěn)定地調(diào)節(jié)食物攝入。DMH^Brs3神經(jīng)元調(diào)節(jié)Tb，能量消耗，BAT活動(dòng)，心率和血壓，對(duì)食物攝入或身體活動(dòng)沒有影響。這些數(shù)據(jù)表明存在專門用于產(chǎn)熱的DMH^Brs3→RPa群體。Brs3也可以作為一種神經(jīng)元標(biāo)記，用于解剖控制能量穩(wěn)態(tài)的神經(jīng)回路。

原文標(biāo)題：

Brs3 neurons in the mouse dorsomedial hypothalamus regulate body temperature, energy expenditure, and heart rate, but not food intake

https://www.nature.com/articles/s41593-018-0249-3