深圳子科生物報道:慢性胰腺炎（chronic pancreatitis）是各種病因引起胰腺組織和功能發(fā)生不可逆改變的慢性炎癥性疾病。它的發(fā)作通常是由與消化蛋白酶或其抑制劑相關(guān)的遺傳因素決定的。PRSS1、SPINK1和CTRC等基因的突變會改變胰蛋白酶水平和胰腺炎風(fēng)險。

重要的是，慢性胰腺炎的遺傳風(fēng)險也可以通過與胰蛋白酶活性無關(guān)的機制來介導(dǎo)，如一些PRSS1突變對胰蛋白酶活性沒有影響，但會導(dǎo)致酶錯誤折疊，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激。同樣地，CPA1（羧肽酶A1）突變也在體外引起酶錯誤折疊，導(dǎo)致CPA1細胞內(nèi)滯留和降解以及相關(guān)的ER應(yīng)激。

盡管體外觀察到的結(jié)果支持突變誘導(dǎo)的錯誤折疊和ER應(yīng)激，但一直缺乏適當(dāng)動物模型的證據(jù)，而CPA1突變的致病機制也是假設(shè)的。這限制了研究人員對疾病機制的了解，也阻礙了新型療法的臨床前試驗。

為此，美國波士頓大學(xué)的研究人員建立了一個新型的小鼠基因敲入品系，在小鼠Cpa1基因座上攜帶人CPA1突變p.N256K。通過對這種小鼠品系的研究，他們證實，CPA1突變導(dǎo)致酶錯誤折疊，并通過ER應(yīng)激的機制引起慢性胰腺炎。這項重要的成果發(fā)表在消化道領(lǐng)域的頂尖雜志《Gut》上，影響因子達17.016。

這項研究的重要意義在于，這是第一個與消化酶錯誤折疊和ER應(yīng)激相關(guān)的慢性胰腺炎小鼠模型。它特別適合測試各種環(huán)境因素（如酒精、吸煙、高脂飲食）或藥物對慢性胰腺炎發(fā)生和發(fā)展的影響。

本文也提供了一個研究新思路，對于一些體外實驗已有結(jié)論但還缺乏活體實驗證實的基因變異疾病，通過構(gòu)建攜帶變異的小鼠模型來進行活體研究不失為一種可行的方法。

在這項研究中，波士頓大學(xué)的Miklós Sahin-Tóth和Eszter Hegyi委托賽業(yè)生物（Cyagen）通過C57BL/6胚胎干細胞的同源重組將人CPA1突變p.N256K敲入小鼠的Cpa1基因座，制備出CPA1點突變小鼠（CPA1 N256K品系）。同時，他們還制備出CPA1 null品系，因為新霉素（neo）表達框的存在導(dǎo)致Cpa1 mRNA和CPA1蛋白表達水平降低。此品系可作為對照，以區(qū)分CPA1蛋白活性喪失或CPA1錯誤折疊。

為了鑒定CPA1 N256K和CPA1 null小鼠品系胰腺中Cpa1 mRNA的表達，研究人員從1月齡的動物中制備胰腺cDNA。定量PCR的分析結(jié)果表明，與C57BL/6N對照相比，CPA1 N256K品系的Cpa1 mRNA表達降低了30%，而CPA1 null品系則降低了95%。Western blot分析也表明，CPA1 N256K品系的CPA1蛋白含量雖降低但仍然明顯，而CPA1 null品系則檢測不到CPA1蛋白的表達（圖1）。

圖1. CPA1 N256K小鼠的制備和突變等位基因的表達。(A) 通過同源重組方法制備出CPA1 null和CPA1 N256K品系。(B) 通過定量PCR檢測1月齡的CPA1 N256K、CPA1 null和C57BL/6N對照小鼠胰腺中Cpa1 mRNA的表達。(C) 通過western blot分析CPA1 N256K、CPA1 null和C57BL/6N對照小鼠胰腺中的CPA1蛋白表達。

之后，他們從6周齡的CPA1 N256K和C57BL/6N對照小鼠中分離胰腺腺泡，并測定CPA1向培養(yǎng)基中的分泌。與野生型的CPA1蛋白相比，CPA1 p.N256K突變體的分泌幾乎檢測不到。相比之下，腺泡細胞裂解液的western blot分析顯示了高水平的CPA1突變蛋白，表明突變蛋白滯留在細胞內(nèi)（圖2）。同時，他們也注意到N256K品系的細胞內(nèi)CPA1蛋白水平略低于對照，表明一些錯誤折疊和滯留的突變蛋白被降解。

圖2. CPA1 N256K和C57BL/6N對照小鼠的腺泡細胞分泌的CPA1蛋白（自發(fā)或雨蛙素誘導(dǎo)）。(A) 添加或未添加30 pM雨蛙素孵育60分鐘后，分泌到培養(yǎng)基中的CPA1。(B) 添加或未添加30 pM雨蛙素孵育60分鐘后，細胞裂解液中的CPA1含量。

研究人員發(fā)現(xiàn)，兩種新的CPA1品系都沒有表現(xiàn)出明顯的表型改變，而且正常繁殖。CPA1 null小鼠和C57BL/6N對照小鼠的胰腺形態(tài)相似。相比之下，CPA1 N256K小鼠從3月齡起就被觀察到胰腺偏小。重量測定證實了CPA1 N256K品系的胰腺出現(xiàn)萎縮。為了鑒定胰腺萎縮的組織學(xué)變化，他們對1、3、6和12月齡的小鼠胰腺切片進行染色，并將它們與對應(yīng)的CPA1 null 和C57BL/6N切片進行比較。

對于CPA1 N256K突變小鼠，研究人員觀察到慢性胰腺炎的標(biāo)志，包括腺泡細胞萎縮和炎性細胞浸潤。Masson三色染色法進一步證實了這一結(jié)論，它揭示了CPA1 N256K小鼠腺泡中的廣泛纖維化。通過細胞角蛋白19和Sox9的免疫組化染色，他們還觀察到腺泡-導(dǎo)管化生（假管復(fù)合物）。相比之下，CPA1 null對照組未表現(xiàn)出胰腺疾病的跡象，與C57BL/6N對照小鼠類似（圖3）。

圖3. CPA1 N256K小鼠的纖維化和腺泡-導(dǎo)管化生。(A) Masson三色染色法顯示CPA1 N256K小鼠的腺泡周圍存在廣泛的纖維化（藍色）。(B) CPA1 N256K小鼠胰腺中的羥脯氨酸含量相對于CPA1 null小鼠和C57BL/6N對照增加。(C) CK19和Sox9的免疫組化結(jié)果顯示CPA1 N256K小鼠存在廣泛的腺泡-導(dǎo)管化生，而CPA1 null小鼠沒有。

最后，為了確定CPA1 N256K品系的組織學(xué)變化是否與ER應(yīng)激標(biāo)志物升高有關(guān)，研究人員分別測定了1月齡、3月齡和12月齡小鼠的伴侶蛋白Hspa5（BiP）和轉(zhuǎn)錄因子Ddit3（CHOP）。與C57BL/6N和CPA1 null對照相比，CPA1 N256K小鼠的BiP表現(xiàn)出一致但適度的上調(diào)，而CHOP在所有時間點表現(xiàn)出明顯的上調(diào)（圖4）。

圖4. CPA1 N256K小鼠、CPA1 null小鼠和C57BL/6N對照小鼠的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物Hspa5和Ddit3的表達，A、B和C分別對應(yīng)1月齡、3月齡和12月齡。對胰腺cDNA樣本進行定量PCR，結(jié)果表示為相對于C57BL / 6N結(jié)果平均值的倍數(shù)變化。

CPA1 N256K基因敲入小鼠上的一系列實驗表明，CPA1突變p.N256K導(dǎo)致酶錯誤折疊，并引發(fā)慢性胰腺炎，同時伴隨著ER應(yīng)激相關(guān)的促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP的上調(diào)。CPA1 null小鼠并沒有觀察到這些病理現(xiàn)象，表明CPA1功能喪失本身并不引起腺泡細胞損傷。錯誤折疊依賴性的通路在慢性胰腺炎中發(fā)揮致病作用，這也為針對ER應(yīng)激相關(guān)機制的治療干預(yù)打下基礎(chǔ)。

研究人員強調(diào)，這種錯誤折疊誘導(dǎo)的慢性胰腺炎新模型有望在臨床前研究中發(fā)揮作用。CPA1 N256K小鼠品系正常發(fā)育和繁殖。這些特征以及胰腺病變的時間線使其成為測試各種環(huán)境損害（酒精、吸煙、高脂飲食）或藥物對慢性胰腺炎影響的理想模型。

原文檢索：

Human CPA1 mutation causes digestive enzyme misfolding and chronic pancreatitis in mice

Gut 2018;0:1–12. doi:10.1136/gutjnl-2018-315994