細菌有特殊的防御機制來保護自己免受病毒的侵害，CRISPR-Cas系統(tǒng)就是其中之一。研究領(lǐng)域的各路高手紛紛大力于開發(fā)源于不同細菌中的各種CRISPR-Cas系統(tǒng)，已經(jīng)成為分子診斷技術(shù)的豐富資源。位于德國維爾茨堡的亥姆霍茲RNA感染研究所(HIRI)的研究人員又進一步開發(fā)了一種新方法來擴展這個CRISPR-Cas工具箱。他們的新方法，——簡稱為PUMA（ (Programmable tracrRNAs Unlock protospacer-adjacent Motif-independent detection of ribonucleic Acids by Cas12 nucleases），可以用Cas12核酸酶檢測RNA，并且被檢測靶標無需PAM，有望在一眾基于CRISPR的檢測新方法中脫穎而出——可是 Cas12核酸酶天然靶向DNA，PUMA是如何可實現(xiàn)高精確度檢測RNA的？研究小組在《Nature Communications》雜志上發(fā)表文章介紹了他們的研究結(jié)果。

背景

除了應(yīng)用于基因組編輯，CRISPR在診斷領(lǐng)域的應(yīng)用同樣獲得高度關(guān)注，CRISPR檢測方法因為相比PCR檢測方法更快速、便宜且便攜，越來越受重視。檢測領(lǐng)域用得較多的有CRISPR相關(guān)(Cas)核酸酶Cas12a?；贑as12核酸酶的dsDNA檢測技術(shù)已經(jīng)成為從疾病診斷到食品質(zhì)量控制和環(huán)境污染物檢測等眾多應(yīng)用的主要焦點，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的十幾個亞型的Cas12同源物中不少被開發(fā)用于核酸檢測。

盡管靶向dsDNA的Cas12核酸酶在核酸檢測中越來越受重視，但它們通常有兩個明顯的限制：嚴格要求側(cè)翼原間隔鄰近基序(PAM)和對dsDNA靶標的限制。這些限制阻礙了在檢測領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。突破這些限制就意味著更廣泛的應(yīng)用前景和”錢景“。

研究亮點

在CRISPR-Cas系統(tǒng)中，CRISPR核糖核酸(crRNA)可以識別外來基因組的區(qū)域——例如病毒DNA，作為“向?qū)NA”指引CRISPR相關(guān)核酸酶(Cas)像剪刀一樣將特定外來基因切割成無害的片段。許多CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)——如在II型CRISPR-Cas系統(tǒng)(例如Cas9)和大多數(shù)V型CRISPR-Cas系統(tǒng)(例如Cas12)——使用反式激活CRISPR RNA (TracrRNAs)產(chǎn)生向?qū)?g)RNA：tracrRNA雜交到crRNAs中的保守重復(fù)區(qū)域，形成的RNA雙鏈、通常由核糖核酸內(nèi)切酶RNase III進行加工并與同源的Cas核酸酶結(jié)合形成復(fù)合物，結(jié)合的RNA雙鏈作為gRNA，指導(dǎo)核酸酶結(jié)合和切割目標dsDNA。

Beisel實驗室與JMU于2021年合作開發(fā)的Cas9診斷平臺LEOPARD時就利用重編程tracrRNA，與感興趣的靶標RNA雜交并將其轉(zhuǎn)化為gRNA，指導(dǎo)Cas9靶向序列特異性DNA，將檢測RNA的存在與Cas9介導(dǎo)的雙鏈DNA切割關(guān)聯(lián)起來。在新研究中，Chase Beisel領(lǐng)導(dǎo)的團隊將LEOPARD的獨特功能擴展到了Cas12——  Cas12相比Cas9更不容易脫靶，Cas12還可以通過獨特的反式切割活性來增加輸出信號，可以實現(xiàn)比Cas9更靈敏的RNA檢測；但這種反式切割活性使得Cas12不像Cas9那樣可以進行多路檢測。研究人員將這種方法命名為PUMA。

重新編程來自不同Cas12核酸酶的TracrRNA，將感興趣的RNA的存在、與dsDNA切割和隨后的側(cè)鏈單鏈DNA切割聯(lián)系起來——重點是：所有這些RNA都不需要原間隔鄰近基序(PAM，protospacer-adjacent motif )。這是通過將PAM設(shè)計到被切割的dsDNA 上而實現(xiàn)的。

作者團隊對不同V型CRISPR-Cas系統(tǒng)相關(guān)的tracrRNAs的重編程，解決了基于Cas12的檢測技術(shù)的兩個挑戰(zhàn)：直接RNA檢測和PAM要求。這個方法通過結(jié)合并將待檢測RNA轉(zhuǎn)化為靶向dsDNA的gRNA，讓靶向dsDNA的Cas12核酸酶能夠?qū)崿F(xiàn)直接檢測RNA——被檢測的底物是RNA，相應(yīng)的dsDNA靶標可以由用戶提供，因此用戶可以完全控制dsDNA靶標的序列、長度和化學(xué)性質(zhì)。PAM被編碼到dsDNA靶標中，繞過了對待測RNA對PAM的要求。幾乎任何RNA序列都可以用PUMA檢測，只要RNA序列遵循闡明的設(shè)計規(guī)則，并且滿足包含抗重復(fù)和向?qū)У淖钚￠L度。他們還發(fā)現(xiàn)縮短的dsDNA靶標可以提高反切活性，提高檢測速度。

然后，作者使用該平臺檢測了來自五種不同細菌病原體的16個S rRNA序列。這些發(fā)現(xiàn)用TracrRNA重編程擴展了靶向dsDNA的Cas12核酸酶檢測，提高了基于CRISPR的RNA檢測的靈活性和多功能性。

克服障礙

Helmholtz RNA感染研究所(HIRI) RNA合成生物學(xué)系主任Chase Beisel說：“CRISPR，通常被稱為‘基因剪刀’，是許多分子技術(shù)的基礎(chǔ)，”“使用PUMA，我們可以重新編程tracrRNA。這使我們能夠決定哪個RNA生物標記物成為向?qū)NA?！?該研究的第一作者Chunlei Jiao解釋說:“這種向?qū)NA反過來將Cas12引導(dǎo)到我們提供的DNA分子上，并激活基因剪刀?！盋hunlei Jiao是實驗室的前研究生和博士后研究員，也參與了LEOPARD的開發(fā)，現(xiàn)在新加坡國立大學(xué)擔任教授。Beisel補充說:“DNA切割告訴我們樣品中存在哪種生物標志物，例如針對不同病原體的生物標志物?！币虼耍@種新方法能夠使用原本只能識別DNA的CRISPR核酸酶檢測RNA生物標志物。“這對于只能在RNA水平上發(fā)現(xiàn)的分子生物標志物尤其重要。例如，這包括RNA病毒，”PUMA不需要特定的識別序列：PAM包含在提供的DNA靶分子中，顯著提高該方法的速度。

一石多鳥

“PUMA有潛力成為一種靈活而精確的RNA檢測工具，”該團隊通過鑒定與急性敗血癥相關(guān)的五種細菌病原體，證明了該方法的潛力。他們的檢測依賴于一個單一的通用的、重編程的tracrRNA，它提供了一種區(qū)分不同類型細菌的簡化方法。這在醫(yī)學(xué)上開辟了廣泛的潛在應(yīng)用。Jiao說:“這項新技術(shù)代表了一種新的CRISPR診斷形式，可以在護理點進行可靠的分子檢測，無論是鑒定病毒或細菌病原體，還是檢測癌癥生物標志物?！?/p>

研究小組已經(jīng)在計劃下一步:“我們的目標是實現(xiàn)與LEOPARD類似的多路讀出，并擴大該技術(shù)的應(yīng)用范圍，”Beisel說，他還預(yù)計該技術(shù)將在研究界得到廣泛應(yīng)用:“我們希望我們的研究將促進對tracrRNA重編程的進一步探索。”