子科生物報道：細(xì)胞的生命活動受到各個亞細(xì)胞器（細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等）中蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的精細(xì)調(diào)控，以保證其有條不紊地進(jìn)行。任一亞細(xì)胞區(qū)域中蛋白質(zhì)“零件”的損壞或失調(diào)，就有可能“牽一發(fā)而動全身”，造成細(xì)胞的異常乃至疾病的發(fā)生。因此，研究亞細(xì)胞區(qū)域的蛋白質(zhì)組，尤其是針對臨床疾病相關(guān)的樣品，一直以來是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點。近年來，鄰近標(biāo)記（proximity labeling）技術(shù)的發(fā)展，突破了傳統(tǒng)亞細(xì)胞器分離方法的局限，使得在活細(xì)胞中原位研究特定亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組成為可能。然而，基于生物催化的鄰近標(biāo)記技術(shù)往往需要對細(xì)胞進(jìn)行基因改造以在胞內(nèi)引入鄰近標(biāo)記酶（如APEX，BioID等），使其不適宜在難以基因改造的樣品（尤其是原代細(xì)胞、臨床樣品）中運用。如何開發(fā)適用于原代活細(xì)胞及組織樣品的鄰近標(biāo)記技術(shù)，成為該領(lǐng)域亟需攻克的挑戰(zhàn)。

文章截圖

近期，以小分子光催化鄰近標(biāo)記為代表的化學(xué)生物學(xué)方法的出現(xiàn)展現(xiàn)出了用于難轉(zhuǎn)染樣品研究的巨大潛力。如諾獎得主MacMillan課題組聯(lián)合默克研究人員開發(fā)了基于光催化產(chǎn)生活性卡賓探針的細(xì)胞膜蛋白質(zhì)鄰近標(biāo)記技術(shù)μMap1，并在此基礎(chǔ)上持續(xù)探索這類新型技術(shù)的應(yīng)用范圍2。北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院的陳鵬/樊新元團(tuán)隊基于光催化產(chǎn)生活性亞甲基醌探針開發(fā)細(xì)胞內(nèi)線粒體蛋白質(zhì)鄰近標(biāo)記技術(shù)CAT-Prox3，細(xì)胞膜受體靶向的CAT-Ex技術(shù)4，細(xì)胞互作鄰近標(biāo)記的CAT-Cell5等技術(shù)。隨后在國內(nèi)外研究者的共同推動下，光催化鄰近標(biāo)記的研究取得了蓬勃發(fā)展，很多創(chuàng)新技術(shù)相繼涌現(xiàn)，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了全新的化學(xué)工具。

然而，組織原代、甚至人體臨床等更為復(fù)雜樣品的原位標(biāo)記由于存在技術(shù)瓶頸而一直處于空白。2024年3月28日，陳鵬/樊新元團(tuán)隊在Nature Communications雜志發(fā)表了題為“Bioorthogonal photocatalytic proximity labeling in primary living samples”的研究論文。他們在前期開發(fā)的線粒體靶向的光催化鄰近標(biāo)記技術(shù)CAT-Prox的基礎(chǔ)上，通過化學(xué)改造開發(fā)出新一代具有更高標(biāo)記活性的硫代亞甲基醌探針，以適應(yīng)更為復(fù)雜的原代組織的生物樣品，從而實現(xiàn)了組織原代、甚至人體臨床樣品的線粒體蛋白質(zhì)的原位標(biāo)記（CAT-S技術(shù)）6。

作者首先基于前期的CAT-Prox技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)性優(yōu)化和升級，特別是針對傳統(tǒng)常用的亞甲基醌（QM）標(biāo)記探針進(jìn)行化學(xué)改造，通過引入硫原子開發(fā)出新一代硫代QM標(biāo)記基團(tuán)（thioQM），在體外及活細(xì)胞內(nèi)展現(xiàn)出比傳統(tǒng)氧代QM顯著提升的蛋白質(zhì)標(biāo)記效率。之后，在多種細(xì)胞系中驗證了該方法對線粒體蛋白質(zhì)的高效捕捉。通過與蛋白質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用，能夠在80%左右的高特異性水平下，定量鑒定300個以上的線粒體蛋白，描繪活細(xì)胞線粒體蛋白質(zhì)組特征；通過綜合分析在多種細(xì)胞系中獲取的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步發(fā)掘并驗證了PTPN1、SLC35A4 uORF及TRABD三個新的線粒體定位蛋白，展現(xiàn)該技術(shù)在發(fā)現(xiàn)新的線粒體蛋白方面的能力。

原代活細(xì)胞樣品（尤其是臨床樣品）上的應(yīng)用一直是鄰近標(biāo)記領(lǐng)域的難點。對此，研究者通過CAT-S技術(shù)實現(xiàn)了對小鼠腎臟、脾臟的解離細(xì)胞樣品中線粒體蛋白的鄰近標(biāo)記捕捉，避免了酶法鄰近標(biāo)記技術(shù)對轉(zhuǎn)基因動物模型的依賴。據(jù)此，研究者定量比較了肥胖誘導(dǎo)II型糖尿病小鼠和健康小鼠中的腎臟線粒體蛋白質(zhì)組特征，發(fā)現(xiàn)一系列在疾病狀態(tài)下表達(dá)變化的線粒體蛋白。其中，脂代謝相關(guān)酶類的變化較為顯著，其中Aldh3a2、Acsm2的下降可能造成了相關(guān)脂質(zhì)代謝物的累積，潛在地促進(jìn)了糖尿病相關(guān)的腎病發(fā)展。此外，研究者還證明了CAT-S技術(shù)能夠?qū)θ搜簶悠分性鶷細(xì)胞進(jìn)行原位線粒體蛋白標(biāo)記，展現(xiàn)了在臨床樣品上的應(yīng)用潛力。

綜上，該工作對生物正交光催化標(biāo)記化學(xué)進(jìn)一步發(fā)展，實現(xiàn)了其在動物組織和臨床來源的原代細(xì)胞的應(yīng)用，并進(jìn)行了原位線粒體蛋白質(zhì)組解析。其無需基因改造、通用性、光控時空分辨等特點，為原代樣品的亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究開辟了新途徑?；谠摬呗?，進(jìn)一步發(fā)展靶向其他亞細(xì)胞區(qū)域的生物正交標(biāo)記方法、探究更多疾病相關(guān)的組學(xué)信息，將是未來值得期待的方向。

樊新元和陳鵬為本文的通訊作者，博士后劉子琦與博士研究生郭?；楸疚牡墓餐谝蛔髡?。該工作得到來自國家自然科學(xué)基金、科技部重點研發(fā)計劃、北京市自然科學(xué)基金、李革-趙寧生命科學(xué)青年研究基金等項目經(jīng)費的支持。

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