?子科生物報(bào)道：復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院彭勃課題組、復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院毛穎課題組和上海市精神衛(wèi)生中心袁逖飛課題組的研究人員開(kāi)展的聯(lián)合攻關(guān)，利用活細(xì)胞成像、嚴(yán)謹(jǐn)譜系追蹤和藥理學(xué)等多個(gè)手段對(duì)NeuroD1介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元重編程現(xiàn)象進(jìn)行了系統(tǒng)性探索。2021年12月6日，相關(guān)研究成果以NeuroD1 induces microglial apoptosis and cannot induce microglia-to-neuron cross-lineage reprogramming為題，發(fā)表在神經(jīng)科學(xué)頂級(jí)期刊《神經(jīng)元》（Neuron）上（圖1）。

圖1 論文首頁(yè)

小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元重編程的構(gòu)想

中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）主要由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞組成。與外周組織器官不同，成年后哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元幾乎不能再生。在神經(jīng)退行性病變中（如阿爾茲海默病、帕金森病、亨廷頓病和腦中風(fēng)等），神經(jīng)元會(huì)大量死亡。死亡的神經(jīng)元無(wú)法再生，從而造成不可逆的嚴(yán)重腦功能損傷。與靜態(tài)的神經(jīng)元不同，膠質(zhì)細(xì)胞具有一定的再生能力。研究人員提出通過(guò)病毒工具操控某個(gè)分子，誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生重編程（reprogramming；或轉(zhuǎn)分化：conversion），使其分化成神經(jīng)元，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元的原位再生（in situ regeneration）。從而利用一類可再生的細(xì)胞（膠質(zhì)細(xì)胞）補(bǔ)充損失的不可再生的細(xì)胞（神經(jīng)元），實(shí)現(xiàn)神經(jīng)退行性病變的治療。膠質(zhì)細(xì)胞的重編程現(xiàn)象首先由德國(guó)馬克斯·普朗克神經(jīng)生物學(xué)研究所的Magdalena G?tz教授課題組闡述，他們?cè)?002年報(bào)告了PAX6可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為神經(jīng)元2。隨后，一系列研究聚焦在該研究領(lǐng)域，包括德州大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心張春立課題組 (SOX2，2013)，賓夕法尼亞州立大學(xué)的陳功課題組 (NeuroD1, 2014)3，HHMI的Marius Wernig和Thomas Südhof課題組 (ASCL1, 2014)4等。這些方案均是通過(guò)操控單個(gè)因子，將星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變成神經(jīng)元。雖然星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠再生，但是其再生能力相對(duì)較弱（即使在depletion-repopulation條件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞平均每天僅能再生0.7%）5。因而，研究人員提出能否通過(guò)誘導(dǎo)其他再生能力強(qiáng)的膠質(zhì)細(xì)胞類型重編程為神經(jīng)元。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)再生能力最強(qiáng)的膠質(zhì)細(xì)胞。復(fù)旦大學(xué)彭勃課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞于再殖條件下，能夠通過(guò)自我增殖的方式平均每天再生20%的細(xì)胞6。若是能通過(guò)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞重編程，那么將相當(dāng)于發(fā)現(xiàn)了一個(gè)無(wú)窮無(wú)盡的補(bǔ)給源，可用來(lái)大量補(bǔ)充受損的神經(jīng)元。來(lái)自日本的Kinichi Nakashima課題組，于2019年報(bào)道了通過(guò)慢病毒異源性表達(dá)NeuroD1，可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞重編程為神經(jīng)元7。然而，領(lǐng)域內(nèi)對(duì)該現(xiàn)象充滿爭(zhēng)議。主要爭(zhēng)議集中在其原理性上：（1）前人所發(fā)現(xiàn)的星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元重編程，兩類細(xì)胞均是來(lái)源于神經(jīng)外胚層譜系，由radial glia分化而來(lái)，親緣關(guān)系較近，可能會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)分化。而小膠質(zhì)細(xì)胞是由卵黃囊中的髓系細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，發(fā)育譜系差別很遠(yuǎn)。若能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元重編程，則這是一類跨譜系的轉(zhuǎn)變，理論上是難以實(shí)現(xiàn)的。（2）前人所發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元重編程的因子（如NeuroD1）均是radial glia分化過(guò)程中與細(xì)胞命運(yùn)決定相關(guān)的因子。然而，NeuroD1并不表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞所在的髓系譜系中，跨譜系表達(dá)如此重要的先導(dǎo)因子（pioneer factor）能否有相應(yīng)的下游元件支撐神經(jīng)外胚層譜系細(xì)胞的命運(yùn)決定亦存疑。同時(shí)，近期還存在關(guān)于NeuroD1介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元重編程是否是實(shí)驗(yàn)假象的重大爭(zhēng)議8。

證明膠質(zhì)細(xì)胞重編程的三個(gè)基本原則

驚人且重大的結(jié)論必須進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那笞C。在該研究中，研究人員提出了充分證明膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元重編程所需的三個(gè)基本原則：（1）通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)拿鞔_的（unambiguous）譜系追蹤，設(shè)置合理設(shè)計(jì)的對(duì)照組（well-designed control）證明，并排除存在病毒泄漏的可能性；（2）通過(guò)明確的（unambiguous）活體/活細(xì)胞成像證據(jù)，觀察到膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元的轉(zhuǎn)變過(guò)程；（3）若是殺掉該類型的膠質(zhì)細(xì)胞，那么該因子所介導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化將不會(huì)發(fā)生。

首先是譜系追蹤，研究人員利用他莫昔芬誘導(dǎo)CX3CR1-CreER::Ai14小鼠的幾乎所有小膠質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)tdTomato（永久標(biāo)記，即使細(xì)胞命運(yùn)發(fā)生轉(zhuǎn)變，依然會(huì)表達(dá)tdTomato）。接下來(lái)，通過(guò)慢病毒hCAG-NeuroD1-T2A-GFP或hCD68-NeuroD1-T2A-GFP感染小膠質(zhì)細(xì)胞。如果小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)NeuroD1后能夠重編程為神經(jīng)元，那么將能發(fā)現(xiàn)一批tdTomato+ GFP+神經(jīng)元。然而，該團(tuán)隊(duì)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這群雙熒光標(biāo)記陽(yáng)性神經(jīng)元的存在（圖2）。為了充分驗(yàn)證該現(xiàn)象，研究團(tuán)隊(duì)在CX3CR1+/GFP小鼠腦內(nèi)引進(jìn)CMV-DIO-mCherryforward-(NeuroD1-T2A-GFP)reverse或CMV-DIO-mCherryforward-GFPreverse慢病毒用來(lái)感染腦細(xì)胞（圖3A）。若是NeuroD1能夠誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元重編程，則能在第一個(gè)病毒處理后觀察到GFP+神經(jīng)元，而作為對(duì)照組的第二個(gè)病毒將觀察不到。然而，不論是通過(guò)何種病毒誘導(dǎo)，均能觀察到很高比例的GFP+神經(jīng)元（圖3），說(shuō)明前人所能觀察到的“小膠質(zhì)細(xì)胞起源神經(jīng)元”是來(lái)自于實(shí)驗(yàn)假象。理論上，在經(jīng)過(guò)他莫昔芬誘導(dǎo)后，病毒僅會(huì)在小膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)生同源重組，從而表達(dá)GFP。但是，研究人員觀察到的現(xiàn)象說(shuō)明利用病毒工具載體進(jìn)行感染時(shí)，會(huì)伴隨有非特異性泄漏的風(fēng)險(xiǎn)。非特異性病毒泄漏可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)論的誤讀。

圖2 In vivo microglia-specific lineage tracing does not support the microglia-to-neuron conversion.

圖3 Lentivirus induces non-specific labeling in vivo, which may confound the microglia-to-neuron observation.

在觀察小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元轉(zhuǎn)變過(guò)程方面，研究人員通過(guò)活細(xì)胞成像方式進(jìn)行觀察，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)表達(dá)NeuroD1的小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生到神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變。恰恰相反，研究人員發(fā)現(xiàn)表達(dá)NeuroD1后，會(huì)引起小膠質(zhì)細(xì)胞的大規(guī)模死亡。通過(guò)BCL2途徑可以對(duì)抗由NeuroD1小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的死亡，說(shuō)明其NeuroD1不僅不能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞重編程，而會(huì)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。這也很好解釋了為何前人和該研究團(tuán)隊(duì)觀察到的“小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元”假象的比例很高（圖3C，>90%）的原因：成功表達(dá)NeuroD1的小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)生凋亡而死去，因而最后剩下的細(xì)胞大都是非特異性泄漏細(xì)胞。

最后，研究人員通過(guò)CSF1R抑制劑PLX5622殺死腦內(nèi)99%的小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)即使在這種情況下，依然會(huì)有很高比例的“小膠質(zhì)細(xì)胞起源神經(jīng)元”，且比例與不殺小膠質(zhì)細(xì)胞的對(duì)照組相當(dāng)（圖4）。因此，研究結(jié)果更加確認(rèn)了前人所觀察到的“小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元重編程”并非真實(shí)情況，而是來(lái)自于病毒非特異性泄漏所產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)假象（圖5）。

圖4 Even under microglia depleted brain, the “microglia-converted neurons” are detected, reflecting a lentiviral leakage artifact.

圖5 該研究主要結(jié)論的總結(jié)。

NeuroD1用于防止替換/移植小膠質(zhì)細(xì)胞失控的分子開(kāi)關(guān)

復(fù)旦大學(xué)彭勃團(tuán)隊(duì)利用小膠質(zhì)細(xì)胞的再生能力，開(kāi)發(fā)了三種方案（Mr BMT, Mr PB和Mr MT），首次在全腦尺度上實(shí)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的高效外源性移植/替換9-12。該方案可用于治療由小膠質(zhì)細(xì)胞突變引起的疾病。然而，細(xì)胞移植所面臨的挑戰(zhàn)之一是如何防止外源性細(xì)胞失控。在小鼠模型中，常用誘導(dǎo)白喉毒素（DT）表達(dá)的方式殺死特性類型的細(xì)胞。由于小鼠沒(méi)有白喉毒素受體，因而死亡細(xì)胞所釋放出的白喉毒素不會(huì)殺死鄰近的細(xì)胞。然而，由于人類細(xì)胞存在白喉毒素受體，因而該方案不能用于臨床實(shí)踐。由于NeuroD1可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，因此該研究團(tuán)隊(duì)提出通過(guò)體外改造的方式，在移植/替換的小膠質(zhì)細(xì)胞中放入誘導(dǎo)表達(dá)NeuroD1的元件。一旦移植/替換的小膠質(zhì)細(xì)胞失控，可以通過(guò)該分子開(kāi)關(guān)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，從而提升小膠質(zhì)細(xì)胞替換/移植的安全性。

上海市精神衛(wèi)生中心饒艷霞博士為該論文的第一作者和共同通訊作者。復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院彭勃教授、復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院毛穎教授和上海市精神衛(wèi)生中心袁逖飛教授為共同通訊作者。該團(tuán)隊(duì)多人為此研究做出貢獻(xiàn)。