?子科生物報(bào)道:逆轉(zhuǎn)座子是一類可以通過(guò)“復(fù)制-粘貼”的方式在基因組上發(fā)生跳躍的DNA元件。R2是低等真核生物中廣泛存在的一種逆轉(zhuǎn)座子。它們專一性地“寄生”在宿主基因組的28S核糖體DNA中，借助宿主基因的啟動(dòng)子，合成自身的mRNA和蛋白質(zhì)并組裝形成R2復(fù)合物（“復(fù)制”過(guò)程）；R2復(fù)合物可再次識(shí)別宿主28S核糖體DNA上的專一性位點(diǎn)，通過(guò)核酸酶（endonuclease, EN）結(jié)構(gòu)域切開DNA雙鏈，再通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase, RT）結(jié)構(gòu)域逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將R2基因序列重新整合到宿主基因組上（“粘貼”過(guò)程），完成“增殖”。

有趣的是，逆轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)的DNA元件在基因組上跳躍的過(guò)程中，極大地豐富了基因組的組成，被認(rèn)為在基因組進(jìn)化的過(guò)程中扮演著重要的作用。因此，理解逆轉(zhuǎn)座子在基因組上跳躍的分子機(jī)制將有助于思考“我們的基因組從哪里來(lái)、如何來(lái)”的問(wèn)題。此外，利用逆轉(zhuǎn)座子在基因組上跳躍的性質(zhì)，開發(fā)新的核酸操縱工具，將具有巨大的應(yīng)用前景（Science， 2023）。

圖1. 逆轉(zhuǎn)座子通過(guò)“復(fù)制-粘貼”在基因組上跳躍的示意圖

2023年6月9日，劉俊杰課題組在《細(xì)胞》（Cell）雜志在線發(fā)表了題為“R2逆轉(zhuǎn)座子中結(jié)構(gòu)性RNA組分監(jiān)督順序性DNA切割”（Structural RNA components supervise the sequential DNA cleavage in R2 retrotransposon）的研究論文。報(bào)道了R2逆轉(zhuǎn)座子的mRNA中存在兩段結(jié)構(gòu)性的RNA，共同調(diào)控DNA雙鏈的順序性切割，從而保證逆轉(zhuǎn)座的準(zhǔn)確進(jìn)行。此外，課題組還將第二類內(nèi)含子（Group II intron）、LINE-1逆轉(zhuǎn)座子與R2逆轉(zhuǎn)座子進(jìn)行了比較，總結(jié)了生物大分子進(jìn)化過(guò)程中，以RNA為主導(dǎo)逐漸過(guò)渡到以蛋白質(zhì)為主導(dǎo)的進(jìn)化趨勢(shì)，提出了新穎的見(jiàn)解。

課題組發(fā)現(xiàn), 位于R2 mRNA 3’端非翻譯區(qū)的RNA（3’-RNA）在R2蛋白質(zhì)切割DNA雙鏈的過(guò)程中，表現(xiàn)出促進(jìn)第一條鏈切割、抑制第二條鏈切割的作用；位于5’端翻譯區(qū)的RNA（5’-RNA）則表現(xiàn)出降低第一條鏈切割、激活第二條鏈切割的作用；而當(dāng)5’-RNA與3’-RNA同時(shí)存在時(shí)，總是表現(xiàn)出3’-RNA的調(diào)控作用，并且完全抑制第二條鏈的切割。為了進(jìn)一步理解其中的分子機(jī)制，課題組解析了R2逆轉(zhuǎn)座子在3’-RNA結(jié)合狀態(tài)和5’-RNA結(jié)合狀態(tài)的高分辨結(jié)構(gòu)。在3’-RNA結(jié)合狀態(tài)中，DNA底物被蛋白質(zhì)特異性識(shí)別，3’-RNA核心區(qū)域結(jié)合在蛋白質(zhì)的RNA結(jié)合（RNA binding, RB）結(jié)構(gòu)域上。在5’-RNA結(jié)合狀態(tài)中，5’-RNA呈現(xiàn)出復(fù)雜的“三爪（three-claw）”結(jié)構(gòu)，緊密的包裹住蛋白質(zhì)核心。值得注意的是，5’-RNA的其中一個(gè)爪（Claw3）同樣結(jié)合在RB結(jié)構(gòu)域上，且生化分析表明，Claw3對(duì)激活第二條鏈切割是必要的。

圖2. 3’-RNA結(jié)合狀態(tài)（左）和5’-RNA結(jié)合狀態(tài)（右）的復(fù)合物結(jié)構(gòu)

此外，課題組用一段連接序列將5’-RNA與3’-RNA連接成一條RNA，設(shè)計(jì)了R2全長(zhǎng)mRNA的模擬物（L-RNA），并獲得了R2逆轉(zhuǎn)座子在L-RNA結(jié)合狀態(tài)的結(jié)構(gòu)。在這個(gè)結(jié)構(gòu)中，5’-RNA同樣以“三爪”的形式與蛋白質(zhì)核心緊密結(jié)合，但由于3’-RNA的擠占，起激活第二條鏈切割作用的Claw3未能與RB結(jié)構(gòu)域結(jié)合。課題組發(fā)現(xiàn)，L-RNA中3’-RNA與蛋白質(zhì)RB結(jié)構(gòu)域的結(jié)合將抑制第二條鏈的切割，但當(dāng)提供dNTP作為原料，使逆轉(zhuǎn)錄可以發(fā)生后，3’-RNA在作為逆轉(zhuǎn)錄模板的過(guò)程中逐漸從RB結(jié)構(gòu)域上解離下來(lái)，5’-RNA得以與RB結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而激活第二條鏈的切割。

圖3. L-RNA結(jié)合狀態(tài)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)與RNA監(jiān)督DNA雙鏈順序性切割的示意圖

綜合以上分析，課題組總結(jié)得出了R2逆轉(zhuǎn)座子在基因組上跳躍的分子機(jī)制：R2蛋白質(zhì)特異性識(shí)別28S核糖體DNA序列后，蛋白質(zhì)RB結(jié)構(gòu)域首先結(jié)合R2 mRNA上的3’-RNA，促進(jìn)第一條DNA鏈的切割，同時(shí)抑制第二條鏈的切割，僅暴露出第一條鏈的3’-OH作為引物，從mRNA的3’端起始逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程（Target-primed reverse transcription, TPRT），隨著逆轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，位于mRNA 3’端的3’-RNA逐漸從蛋白質(zhì)RB結(jié)構(gòu)域解離，對(duì)第二條鏈切割的抑制作用得以釋放，R2 mRNA上的5’-RNA與RB結(jié)構(gòu)域的結(jié)合進(jìn)一步激活了第二條鏈的切割。由此，位于mRNA兩端的結(jié)構(gòu)性RNA共同監(jiān)督了DNA雙鏈的順序性切割。這種嚴(yán)密的順序性切割保障了依賴宿主基因表達(dá)元件的R2逆轉(zhuǎn)座子進(jìn)行“有效的增殖”，從而在28S核糖體DNA中不斷產(chǎn)生有活性的拷貝。

圖4. R2逆轉(zhuǎn)座子在基因組上發(fā)生跳躍的分子機(jī)制與意義

有趣的是，課題組將低等真核生物的R2逆轉(zhuǎn)座子與其祖先（原核生物第二類內(nèi)含子，Group II intron）和哺乳動(dòng)物中的LINE-1逆轉(zhuǎn)座子進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在Group II intron向R2逆轉(zhuǎn)座子及進(jìn)一步向LINE-1逆轉(zhuǎn)座子進(jìn)化的過(guò)程中，RNA的結(jié)構(gòu)性組分逐漸減少并被編碼區(qū)域所取代，并且催化功能逐漸從以RNA為主導(dǎo)過(guò)渡到以蛋白質(zhì)為主導(dǎo)，為理解生物大分子進(jìn)化提供了新的視角。此外，LINE-1逆轉(zhuǎn)座子在哺乳動(dòng)物基因組中廣泛存在且具有逆轉(zhuǎn)座活性，為基因組提供進(jìn)化驅(qū)動(dòng)力的同時(shí)，也為基因組穩(wěn)定性和基因表達(dá)帶來(lái)了重大的影響。對(duì)R2逆轉(zhuǎn)座子在基因組上跳躍的分子機(jī)制的研究，將啟發(fā)我們思考LINE-1逆轉(zhuǎn)座子這類“自私的基因”與基因組之間精彩的博弈過(guò)程。

圖5.逆轉(zhuǎn)座子中RNA與蛋白質(zhì)共進(jìn)化趨勢(shì)的示意圖

清華大學(xué)生命學(xué)院劉俊杰助理教授和副研究員王家為本文共同通訊作者；高精尖結(jié)構(gòu)中心卓越學(xué)者鄧譜涓博士和清華大學(xué)生命學(xué)院2021級(jí)博士生譚順青為本文共同第一作者；清華大學(xué)生命學(xué)院本科生楊啟羽，2020級(jí)博士生朱漢舟，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所王皓毅研究員及博士生傅良政、吳亞超，清華大學(xué)生命學(xué)院張強(qiáng)鋒副教授及已出站博士后孫磊（現(xiàn)山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員），清華大學(xué)生命學(xué)院吝易助理教授及博士生包章彬均參與了本文研究。美國(guó)Broad研究所張鋒教授和Max E. Wilkinson博士在原子模型搭建中提供了寶貴的建議。清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)為本研究提供了設(shè)備和技術(shù)支持。本研究得到了中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、科技部2030-“腦科學(xué)與類腦研究”重大項(xiàng)目、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、劉俊杰實(shí)驗(yàn)室啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)、中國(guó)博士后科學(xué)基金和中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略先導(dǎo)專項(xiàng)的支持。