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子科生物報(bào)道：冷凍電子斷層成像（cryo-ET）是在原位環(huán)境下發(fā)現(xiàn)并解析新結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)跨尺度生物成像的重要結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段。近年來cryo-ET領(lǐng)域蓬勃發(fā)展：一方面，cryo-ET數(shù)據(jù)采集及后續(xù)數(shù)據(jù)處理方法的技術(shù)革新帶來了分辨率的革命性突破；另一方面，細(xì)胞環(huán)境下的目標(biāo)識別技術(shù)及減薄冷凍細(xì)胞樣品技術(shù)的發(fā)展，使在10萬倍放大倍數(shù)下直接觀察生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)過程成為可能。這兩方面的革新相輔相成，極大地促進(jìn)了在宿主細(xì)胞中原位高分辨觀測病毒活動的研究新方向（圖1），為病毒學(xué)研究、藥物疫苗開發(fā)提供了寶貴的原位機(jī)制發(fā)現(xiàn)。

2023年5月10日，清華大學(xué)生命學(xué)院李賽團(tuán)隊(duì)在Annual Review of Biophysics發(fā)表題為《冷凍電子斷層成像的分辨率革命及伴隨涌現(xiàn)的原位病毒學(xué)發(fā)現(xiàn)》（Cryo-Electron Tomography: The Resolution Revolution and a Surge of In Situ Virological Discoveries）的綜述文章。該文章系統(tǒng)總結(jié)了cryo-ET領(lǐng)域近年來的技術(shù)革新、分辨率突破及伴隨其涌現(xiàn)的原位結(jié)構(gòu)病毒學(xué)發(fā)現(xiàn)，并對該領(lǐng)域的未來研究進(jìn)行了展望。

填補(bǔ)空白：cryo-ET填補(bǔ)傳統(tǒng)生物顯微技術(shù)的空白地帶

每種生物成像技術(shù)都有各自擅長的觀測尺度和對應(yīng)的分辨率范圍。在傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)數(shù)十納米的觀測尺度到光學(xué)顯微成像技術(shù)數(shù)百納米的分辨率之間存在著一個(gè)數(shù)量級的“空白地帶”，而cryo-ET技術(shù)的觀測尺度及分辨率剛好可以完美填補(bǔ)這一空缺（圖1）。

Cryo-ET技術(shù)通過對樣品多個(gè)角度拍照獲得傾轉(zhuǎn)系列（tilt series, TS），將其重構(gòu)為三維斷層圖像，再使用子斷層平均法（sub-tomogram averaging, STA）進(jìn)行高分辨率結(jié)構(gòu)解析。相比傳統(tǒng)的冷凍電鏡方法，cryo-ET技術(shù)有著優(yōu)秀的層析能力，對樣品純度要求較低，無需使其脫離原生環(huán)境，能最大程度保留生物樣品的自然狀態(tài)。因此對于尺度在100納米左右，結(jié)構(gòu)形態(tài)均一性較差，且難以體外重組表達(dá)的囊膜病毒而言，cryo-ET可謂是極佳的研究方法。近5年來，cryo-ET迎來全面發(fā)展，層出不窮的技術(shù)革新在不斷拓展其觀測范圍與分辨率極限，使不同尺度生物樣品的原位觀察更加流暢自然。

圖1：Cryo-ET填補(bǔ)傳統(tǒng)顯微及結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)的空白地帶（Sai Li; Trends in Biochemical Sciences, 2022; 47(2): 173-186）

Cryo-ET的分辨率革命：為原位觀測大分子機(jī)器近原子分辨率結(jié)構(gòu)打開嶄新窗口

Cryo-ET面對的生物體系復(fù)雜，采集的數(shù)據(jù)規(guī)模龐大，處理起來環(huán)節(jié)繁多。因此，從制樣到采集數(shù)據(jù)，再到結(jié)構(gòu)解析，cryo-ET的工作流程存在多個(gè)影響分辨率的因素。這也成為制約cryo-ET分辨率突破的主要原因。本綜述針對當(dāng)前讓人應(yīng)接不暇的數(shù)據(jù)處理軟件和流程進(jìn)行了全面而細(xì)致的梳理：分別從前期的數(shù)據(jù)采集、預(yù)處理和后期結(jié)構(gòu)計(jì)算三個(gè)方面，篩選出具有“里程碑”意義的突破性技術(shù)，并總結(jié)了“冷凍電鏡分辨率革命”以來cryo-ET近十年的技術(shù)發(fā)展以及對應(yīng)的分辨率突破（圖2）。

在前期數(shù)據(jù)采集及處理方面，本文分別總結(jié)了最大程度保留數(shù)據(jù)高分辨信息的傾轉(zhuǎn)系列采集方案，以及提高傾轉(zhuǎn)系列采集通量的方法學(xué)探索歷程，并梳理了針對傾轉(zhuǎn)系列數(shù)據(jù)特點(diǎn)進(jìn)行位移校正（motion correction）、襯度傳遞函數(shù)校正（CTF correction）、傾轉(zhuǎn)系列對齊（tilt-series alignment）以及斷層圖像重構(gòu)（tomogram reconstruction）在內(nèi)的算法革新。后期結(jié)構(gòu)計(jì)算方面，本文總結(jié)了利用人工智能輔助顆粒挑選的方法，及Relion 4，Warp & M，EMClarity等軟件在顆粒對齊、分類、平均及循環(huán)糾正等步驟的算法創(chuàng)新。這些數(shù)據(jù)采集方案及處理算法的革新，逐步將cryo-ET的分辨率推進(jìn)至如今的2-3埃，最終迎來了cryo-ET領(lǐng)域的分辨率革命，從而為原位觀測大分子機(jī)器精細(xì)結(jié)構(gòu)研究打開嶄新窗口。

圖2：“冷凍電鏡分辨率革命”以來，cryo-ET近十年的分辨率發(fā)展。一系列重要的技術(shù)革新，推動了cryo-ET的分辨率革命

眼見為實(shí)：一系列原位結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，正將病毒生命周期的“示意圖”轉(zhuǎn)變?yōu)椤敖Y(jié)構(gòu)現(xiàn)實(shí)”

全面了解病毒在宿主體內(nèi)的生命周期是病毒學(xué)研究的重中之重，基于此我們才能從中發(fā)現(xiàn)漏洞，篩選靶點(diǎn)，有針對性地開發(fā)抗病毒藥物及抗體。從一顆病毒入侵宿主細(xì)胞到大量子代病毒的釋放，病毒在細(xì)胞內(nèi)的行為千差萬別，花樣繁多。曾幾何時(shí)，我們關(guān)于病毒“生命周期”的理解，主要來自于傳統(tǒng)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)、熒光顯微鏡及常溫切片電鏡觀測。然而，隨著快速投入式冷凍制樣、高壓冷凍制樣、冷凍光電聯(lián)合成像（cryo-CLEM）、電鏡可見的特異性生物標(biāo)記、冷凍聚焦離子束減薄（cryo-FIB milling）、相位板（VPP）、基于人工智能的圖像識別、降噪和圖形分割等一系列cryo-ET相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，病毒生命周期的“示意圖”正逐步轉(zhuǎn)變?yōu)椤敖Y(jié)構(gòu)現(xiàn)實(shí)”。

本文分別梳理了真核細(xì)胞及原核細(xì)胞內(nèi)病毒的生命周期，并將其劃分為三個(gè)階段：第一階段：病毒入侵宿主細(xì)胞，釋放基因組；第二階段：病毒誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)形成復(fù)制工廠并進(jìn)行基因組的大量復(fù)制；第三階段：子代病毒組裝成型并脫離宿主細(xì)胞開啟新一輪感染。同時(shí)，本文詳細(xì)歸納了以上病理過程中的重要大分子結(jié)構(gòu)，例如病毒復(fù)制工廠的孔道復(fù)合物、處于不同進(jìn)程的病毒組裝中間體以及正在向宿主遞送基因組的噬菌體分子機(jī)器等。近五年來，此類研究成果快速涌現(xiàn)，大量不為人知、甚至曾被錯(cuò)誤理解的病毒活動，終于得到眼見為實(shí)的證據(jù)（圖3）。這些發(fā)現(xiàn)為藥物靶點(diǎn)選擇提供了有力的參考信息。

圖3：通過揭示細(xì)胞內(nèi)病毒活動的原位機(jī)制，cryo-ET正逐步將病毒生命周期的“示意圖”轉(zhuǎn)變?yōu)椤敖Y(jié)構(gòu)現(xiàn)實(shí)”

分辨率革命只是開始：展望Cryo-ET的技術(shù)發(fā)展

本綜述不僅對cryo-ET近十年來的技術(shù)革新和分辨率發(fā)展進(jìn)行了細(xì)致的梳理，也歸納了cryo-ET揭示的病毒重要原位結(jié)構(gòu)及入侵、復(fù)制機(jī)制。隨著cryo-ET技術(shù)的的不斷發(fā)展，它不僅為微生物領(lǐng)域帶來大量新發(fā)現(xiàn)，也被廣泛應(yīng)用在神經(jīng)生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、植物等領(lǐng)域。

然而，作為一門年輕的技術(shù)，cryo-ET領(lǐng)域仍有大量難題亟待解決。首先，相較于傳統(tǒng)的冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)，cryo-ET的工作流程整體更加復(fù)雜耗時(shí)且分辨率較低。本文指出開發(fā)可靈活組合使用的整合工具包將極大提升cryo-ET的工作效率。要提升子斷層平均結(jié)構(gòu)的分辨率需要從低信噪比數(shù)據(jù)中盡量完整有效地提取高頻信息用于計(jì)算，這是cryo-ET結(jié)構(gòu)計(jì)算領(lǐng)域的一大重要目標(biāo)。此外，電鏡圖像雖能保留大量高頻信息但其信噪比較低，常常難以鎖定細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)分子。為此，聯(lián)合其他顯微手段，并通過開發(fā)新型樣品特異性標(biāo)記方式，可以幫助我們在細(xì)胞內(nèi)尋找感興趣的生物學(xué)事件。