子科生物報(bào)道：在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，飼料引起腸黏膜慢性炎癥的情況尤為常見，同時(shí)腸黏膜免疫屏障也經(jīng)常是水產(chǎn)病源（如病毒、細(xì)菌等）入侵的首當(dāng)其沖的位置。因而，對(duì)于魚類腸炎的研究已成為最近水產(chǎn)疾病的基礎(chǔ)研究熱點(diǎn)。 

　　目前，斑馬魚已成為腸粘膜免疫研究的常見模式動(dòng)物，應(yīng)用于疾病建模以及藥物篩選。中國科學(xué)院水生生物研究所魚類功能基因組學(xué)學(xué)科組科研人員利用斑馬魚開發(fā)了一整套腸炎研究體系，包括幼魚的固有免疫階段和適應(yīng)性免疫階段的腸黏膜免疫細(xì)胞成像分析方法[1, 2]，以及成魚的豆粕誘導(dǎo)腸炎（SBMIE）的病理和多組學(xué)分析方法?；诎唏R魚食源性腸炎模型，進(jìn)行了一系列水產(chǎn)藥物開發(fā)[3,4,5]。但是，關(guān)于藥物在魚體內(nèi)起效的免疫機(jī)理的深入解析，還需要對(duì)成魚腸粘膜免疫在細(xì)胞水平上的研究進(jìn)行方法上的突破。 

　　近日，該團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新了斑馬魚腸黏膜免疫細(xì)胞懸液的制備操作方法，開發(fā)了一套快速簡(jiǎn)單的操作方法，用于制備來自腸粘膜的免疫細(xì)胞懸液。通過反復(fù)吹打，可將腸絨毛肌層以上部分的免疫細(xì)胞分離出來（圖1）。與經(jīng)濟(jì)魚常用的網(wǎng)搓法相比，吹打法對(duì)斑馬魚黏膜組織細(xì)胞活性的損失較小。再采用流式細(xì)胞術(shù)，結(jié)合熒光標(biāo)記免疫細(xì)胞的分門策略，可精確分離斑馬魚腸黏膜免疫細(xì)胞群中的各種免疫細(xì)胞類群，包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。本方法是對(duì)于斑馬魚腸黏膜炎癥模型的有效技術(shù)補(bǔ)充，可更好地在細(xì)胞水平探究斑馬魚腸黏膜免疫的機(jī)理。 

圖1 粘膜免疫細(xì)胞懸液的制備操作圖解

　　在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚腸黏膜細(xì)胞懸液細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)結(jié)團(tuán)率較低，多數(shù)粒徑在10μm左右。采用免疫細(xì)胞熒光標(biāo)記的斑馬魚品系來分離，發(fā)現(xiàn)AO/PI染色后，與傳統(tǒng)的網(wǎng)搓法相比，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所得細(xì)胞活性大幅提高，細(xì)胞基本無粘連，熒光表達(dá)和細(xì)胞形態(tài)均良好（圖2）。對(duì)腸組織和處理后剩余部分進(jìn)行切片觀察發(fā)現(xiàn)，處理后僅剩肌層與漿膜層，而上皮層與固有層已不可見，暗示其中細(xì)胞已被制為懸液。而qPCR和轉(zhuǎn)錄組分析均能進(jìn)一步證明分離細(xì)胞的組成。結(jié)果表明分離細(xì)胞組的免疫細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)量顯著高于腸組織本身，而MUC基因表達(dá)熱圖也表明在分離細(xì)胞組優(yōu)勢(shì)表達(dá)的為內(nèi)層黏蛋白基因；KEGG富集分析也在分離細(xì)胞組中發(fā)現(xiàn)大量免疫相關(guān)通路。 

圖2 熒光標(biāo)記的腸黏膜免疫細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析表明本方法在細(xì)胞活性和得率上具有優(yōu)勢(shì)

　　進(jìn)一步，對(duì)目前的吹打法制備的細(xì)胞懸液及其流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行了應(yīng)用。在對(duì)各類型的免疫細(xì)胞（熒光標(biāo)記）進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析，與網(wǎng)搓法比，吹打法能顯著提高腸黏膜來源的細(xì)胞懸液中免疫細(xì)胞的得率；而對(duì)其他免疫組織（外周血、頭腎、脾臟、肝臟）來源的細(xì)胞懸液的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)腸免疫細(xì)胞比例符合魚類免疫細(xì)胞的正常分布比例。通過吹打法在斑馬魚SBMIE腸炎模型中的應(yīng)用分析，表明該方法能夠準(zhǔn)確反映腸炎相關(guān)免疫細(xì)胞比例變化（圖3）。 

　　因此，目前在斑馬魚中開發(fā)的腸黏膜免疫細(xì)胞懸液制備及分離分析的方法，提供了研究模式魚類的腸黏膜免疫細(xì)胞的實(shí)用技術(shù)。本方法可應(yīng)用于水產(chǎn)腸炎病理研究，即病源或者食源中的抗原、抗?fàn)I養(yǎng)因子等引起的黏膜屏障功能失調(diào)，乃至經(jīng)腸吸收的飼料添加的功能成分或替抗藥物（如功能性植物成分或中草藥）的抗病效果評(píng)價(jià)，可對(duì)其在維持腸粘膜免疫穩(wěn)態(tài)中的作用進(jìn)行細(xì)胞水平的機(jī)制解析。另一方面，對(duì)于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中的結(jié)腸炎斑馬魚模型來說，化學(xué)物質(zhì)DSS、TNBS等誘導(dǎo)的克羅恩?。–rohn’s Disease, CD）、潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis, UC）的模型，本方法也適用，可提供在細(xì)胞水平上的研究手段支持。 

圖3 本方法在斑馬魚SBMIE模型中對(duì)免疫細(xì)胞的分析應(yīng)用

　　本研究是在吳南副研究員主持的中國科學(xué)院江西產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新與育成中心科技支撐產(chǎn)業(yè)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目“水產(chǎn)替抗功能植物篩選與漁用技術(shù)研發(fā)”（ZKYJXZXCY-202210）、以及國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31872592）的共同資助下，由碩士研究生趙旭陽、劉宇航、謝家元等人共同完成，夏曉勤研究員和吳南副研究員為共同通訊作者。相關(guān)研究成果在Frontiers in Immunology雜志發(fā)表（DOI: 10.3389/fimmu.2023.1193977），題為《The manipulation of cells suspension from zebrafish intestinal mucosa contributes to understanding enteritis》，收錄于魚類黏膜免疫研究的熱點(diǎn)專題“Mucosal Barrier in Teleost Fish: Physical Biochemical and Immune Nature”。 

　　參考文獻(xiàn)： 

　　1. 黎明，謝家元，李曉敏，王銳，單俊瑋，趙旭陽，程瑩寅，張婉婷，吳南*，夏曉勤*. 斑馬魚食源性腸炎模型及其免疫細(xì)胞成像分析方法的建立. 水生生物學(xué)報(bào)，2022，46（2），1-12. 

　　2. M Li, X Zhao, J Xie, X Tong, J Shan, M Shi, G Wang, W Ye, Y Liu, BH Unger, Y Cheng, W Zhang, N Wu* and X-Q Xia*. Dietary Inclusion of Seabuckthorn (Hippophae rhamnoides) Mitigates Foodborne Enteritis in Zebrafish Through the Gut-Liver Immune Axis, Frontiers in Physiology, 2022, 13, 831226. 

　　3. J Xie, M Li, W Ye, J Shan, X Zhao, Y Duan, Y Liu, BH Unger, Y Cheng, W Zhang, N Wu* and X-Q Xia*. Sinomenine hydrochloride ameliorates fish foodborne enteritis via α7nAchR mediated anti-inflammatory effect whilst altering microbiota composition, Frontiers in Immunology, 2021, 12, 766845. 

　　4. N Wu*, X Xu, B Wang, XM Li, YY Cheng, M Li, XQ Xia and YA Zhang. Anti-foodborne enteritis effect of galantamine potentially via acetylcholine anti-inflammatory pathway in fish. Fish and Shellfish Immunology, 2019, 97, 204-215.