子科生物報(bào)道:cGAS-STING通路是負(fù)責(zé)識別胞質(zhì)DNA免疫應(yīng)答的主要通路 1。cGAS作為胞質(zhì)DNA受體，可以被DNA和/或Mn2+ 激活并利用ATP和GTP合成第二信使2’3’-cGAMP，后者進(jìn)一步激活STING并誘導(dǎo)I型干擾素等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而介導(dǎo)抗感染/腫瘤免疫反應(yīng)。研究表明多種病原微生物入侵及各種壓力脅迫，如氧化應(yīng)激、代謝紊亂及DNA損傷等都可導(dǎo)致胞質(zhì)DNA的累積及Mn2+ 濃度的升高，從而激活cGAS-STING通路。因此，cGAS-STING信號通路在抵抗病原微生物感染、腫瘤及多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)生及治療中都發(fā)揮關(guān)鍵作用。

磷脂酰肌醇磷酸（phosphoinositides, PIPs）是構(gòu)成真核生物細(xì)胞膜組分的重要磷脂（占總磷脂的5-10%），也是重要的信號分子 2。由于肌醇六元環(huán)上D-3，D-4或D-5位都可發(fā)生磷酸化修飾，因此真核生物中總共存在7種不同PIP分子。PI4P（phosphatydyinositol 4-phosphate）是胞內(nèi)含量最高的PIP分子，廣泛分布于各種膜組分，且在反式高爾基體（trans-Golgi network, TGN）上的含量最高。細(xì)胞中的PI4P的含量主要受其合成酶PI4Ks (PI4KA, PI4KB, PI4K2A和PI4K2B)和降解酶SAC1的調(diào)控。PI4P不僅是合成PIP2和PIP3的前體，也是重要的信號分子，在膜泡運(yùn)輸、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞器形態(tài)維持等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2021年蔣爭凡實(shí)驗(yàn)室利用STING自激活突變體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的特性，在HT080細(xì)胞中進(jìn)行了基于CRISPR-Cas9介導(dǎo)的全基因組篩選，發(fā)現(xiàn)高爾基體腔內(nèi)合成的硫酸化糖胺聚糖（sGAGs）可以通過結(jié)合到STING跨膜區(qū)的腔內(nèi)側(cè)，從而誘導(dǎo)STING的寡聚及激活 3。該論文的討論部分提到STING和sGAGs的相互作用受到STING腔內(nèi)側(cè)pH值的調(diào)控，并由此推測STING在pH更低的后高爾基體囊泡（post-Golgi vesicles）中會有更高的活性。但是在這個研究中，他們沒有解釋STING為什么需要及如何轉(zhuǎn)運(yùn)到后高爾基體囊泡。

2023年3月14日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蔣爭凡實(shí)驗(yàn)室在《Immunity》上以research article形式在線發(fā)表了“ARMH3-mediated recruitment of PI4KB directs Golgi-to-endosome trafficking and activation of the antiviral effector STING”，報(bào)道了ARMH3作為接頭蛋白招募PI4KB到STING，PI4KB通過合成PI4P促進(jìn)STING從高爾基體到內(nèi)體的轉(zhuǎn)運(yùn)（Golgi-to-endosome trafficking）及維持STING激活所需要的脂膜環(huán)境（lipid environment），從而幫助STING更加穩(wěn)定高效的激活。

本工作首先通過CRISPR-Cas9介導(dǎo)的全基因組篩選在HeLa細(xì)胞系中鑒定到一個未知功能的新基因C10ORF76 (又名ARMH3)對STING的激活十分重要（圖一A）。ARMH3是一個鮮少被研究的蛋白，為數(shù)不多的幾篇文章暗示了它對于PI4KB發(fā)揮激酶活性來磷酸化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）生成PI4P十分重要。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)STING激活后和ARMH3，PI4KB及PI4P都在反式高爾基體有明顯的共定位。進(jìn)一步免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，STING只有在ARMH3存在的情況下和PI4KB有互作（圖一B），表明ARMH3在STING和PI4KB之間起到橋梁作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明ARMH3分別結(jié)合位于STING第二、三跨膜區(qū)之間的連接區(qū)域及位于PI4KB激酶結(jié)構(gòu)域中間的連接區(qū)域。突變掉STING負(fù)責(zé)結(jié)合ARMH3的氨基酸或者利用CRISPR-Cas9原位刪除PI4KB與ARMH3互作的關(guān)鍵區(qū)域（6個氨基酸殘基）都會顯著削弱cGAS-STING通路的激活。這些結(jié)果表明ARMH3招募PI4KB對于STING的激活十分關(guān)鍵。更重要的是，細(xì)胞內(nèi)敲除ARMH3或者原位刪除PI4KB結(jié)合ARMH3所需的6個氨基酸，STING在上游通路活化后幾乎呈現(xiàn)完全的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位，暗示如果2’3-cGAMP結(jié)合后被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體的STING無法被繼續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)到后高爾基體囊泡，將會被細(xì)胞內(nèi)COPI/AP1介導(dǎo)的從高爾基體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并完全抑制STING的活化。

為了更直接的研究PI4KB對STING激活的影響，他們使用雷帕霉素誘導(dǎo)的FKBP和FRB相互作用，直接招募PI4KB-GFP-FKBP到STING-mCherry-FRB，并發(fā)現(xiàn)招募PI4KB到STING會顯著促進(jìn)STING聚集體的形成及下游信號通路的激活（圖一C），且這種對于STING通路的激活能力完全依賴于PI4KB的激酶活性。相反，招募PI4P的磷酸酶SAC1到STING則會抑制STING聚集體的形成及下游信號通路的激活。表明PI4KB通過在STING周圍合成PI4P促進(jìn)STING的激活。有趣的是，SAC1的敲低會引起的細(xì)胞內(nèi)PI4P水平的異常升高，進(jìn)而導(dǎo)致STING不依賴于cGAS的自激活。TMEM39A是一個自身免疫性疾病相關(guān)基因且被報(bào)道參與細(xì)胞內(nèi)的PI4P水平的調(diào)控 4。同樣，TMEM39A的敲低也會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)PI4P的水平的異常升高及STING的自激活，該發(fā)現(xiàn)有助于理解TMEM39A相關(guān)自身免疫疾病的致病機(jī)制。此外，SCAP 和NPC1的突變也被報(bào)道可以引起細(xì)胞內(nèi)PI4P的水平的異常升高及STING的自激活 5-8，提示胞內(nèi)PI4P水平的異常升高可能是這些基因突變導(dǎo)致STING自激活的共同原因。

為了研究PI4P如何影響STING的激活，他們對23個PI4P結(jié)合蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)性地敲低并發(fā)現(xiàn)其中9個成員的降低表達(dá)會使STING的激活嚴(yán)重受損（圖一D）。功能分析表明這9個PI4P結(jié)合蛋白可以分為兩類。其中AP-1和GGA2負(fù)責(zé)介導(dǎo)高爾基體到內(nèi)體的膜泡運(yùn)輸。由于內(nèi)體中相對更低的pH值有利于STING與sGAGs的結(jié)合，他們推測PI4P 可以通過指導(dǎo)AP-1和GGA2介導(dǎo)的clathrin-coated vesicles (CCVs) 將STING從高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)體從而避免STING被運(yùn)回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并且更加強(qiáng)烈激活STING。另一類PI4P結(jié)合蛋白均為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中OSBP和ORPs負(fù)責(zé)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體或內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇，CERT負(fù)責(zé)神經(jīng)酰胺從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)。神經(jīng)酰胺在高爾基體上會在SGSM1的催化下轉(zhuǎn)化為鞘磷脂，且SGSM1在細(xì)胞內(nèi)的敲除會顯著削弱STING的激活，提示鞘磷脂而非神經(jīng)酰胺直接作用于STING。通過特異的化學(xué)小分子破壞膽固醇和鞘磷脂在脂膜上的分布會使STING聚集體逐漸消散并顯著抑制STING下游信號通路的激活，表明膽固醇和鞘磷脂對STING聚集體的形成和激活十分關(guān)鍵。以上結(jié)果共同表明PI4P還可以通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白維持STING活化所需的脂膜環(huán)境進(jìn)而影響STING的激活。此外，Lyz-Cre介導(dǎo)的Armh3條件敲除小鼠實(shí)驗(yàn)表明Armh3在機(jī)體對抗DNA病毒感染過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)：1）STING為什么需要離開及如何離開高爾基體（后高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)（post-Golgi trafficking））的分子機(jī)制（圖二）；2）一個功能未知蛋白ARMH3（可能還具有GEF活性，激活膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)中非常重要的Small GTPase Arf1）在cGAS-STING通路中的重要作用；3）脂膜環(huán)境對STING的活化十分關(guān)鍵；4）細(xì)胞內(nèi)PI4P水平的異常升高可以導(dǎo)致非依賴于cGAS的STING分子自激活（cGAS-independent STING autoactivation）。重要的是，這種現(xiàn)象在很多脂質(zhì)代謝紊亂的自身免疫病患者中被發(fā)現(xiàn)及報(bào)道。鑒于PI4P在脂質(zhì)運(yùn)輸及脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)維持中的核心作用，他們的研究還提示STING作為一個潛在的細(xì)胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)感受器（lipid homeostasis sensor），可能是細(xì)胞內(nèi)的一種新型危險(xiǎn)信號感受器。

北京大學(xué)生科院博士后方潤和蔣啟飛為該文章的共同第一作者，2022級研究生賈新穎也為本研究做出貢獻(xiàn)。生科院/北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的蔣爭凡教授為通訊作者。本研究工作得到了國家自然科學(xué)基金委、科技部國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目、北京大學(xué)“細(xì)胞增殖與分化”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及“北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心”的資助。