子科生物報(bào)道：汪陽(yáng)明實(shí)驗(yàn)室最近鑒定了多個(gè)來(lái)源于微生物中的雙鏈DNA脫氨酶，并將其中一種改造成為線粒體堿基編輯器（圖1）。該項(xiàng)成果1于2023年2月16日在《自然-通訊》（ Nature Communications ）在線發(fā)表，論文題目為“DddA homolog search and engineering expand mitochondrial base editing”，論文鏈接https://www.nature.com/articles/s41467-023-36600-2。

圖1.思邈菌DddA衍生的線粒體堿基編輯器成功編輯多個(gè)線粒體基因組位點(diǎn)。

細(xì)胞中的生物學(xué)反應(yīng)在種類繁多的細(xì)胞器中發(fā)生，其中線粒體十分特別，它是細(xì)胞的能量工廠，為細(xì)胞乃至人體活動(dòng)提供能量，并且在多個(gè)層面參與細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的生死存亡和命運(yùn)。更有意思的是，線粒體擁有自己的DNA。細(xì)胞中已知只有兩種細(xì)胞器擁有自己的DNA，另一種是葉綠體。目前已發(fā)現(xiàn)有上百種線粒體DNA的突變能夠?qū)е氯祟惣膊。ǘ@、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病。如何糾正這些DNA突變來(lái)治療人類疾病，以及如何誘導(dǎo)特定的突變來(lái)模擬人類疾病和研究線粒體基因的功能，始終是領(lǐng)域內(nèi)的難題。

對(duì)于細(xì)胞核中的DNA，科學(xué)家們可以通過(guò)CRISPR系統(tǒng)結(jié)合DNA脫氨酶實(shí)現(xiàn)特定堿基的高效突變。然而該系統(tǒng)由于外源RNA難以高效轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)部（有爭(zhēng)議），在線粒體編輯中尚無(wú)實(shí)際應(yīng)用。這一問(wèn)題的解決得益于一類新的DNA脫氨酶的發(fā)現(xiàn)。與CRISPR系統(tǒng)聯(lián)用的堿基編輯酶都是單鏈DNA脫氨酶，2020年左右Mougous實(shí)驗(yàn)室在伯克霍爾德菌中發(fā)現(xiàn)了一種脫氨酶，可以在雙鏈DNA上工作，因此命名為雙鏈DNA脫氨酶（Double strand DNA deaminase, DddA）。雙鏈脫氨酶是細(xì)菌對(duì)抗不同種屬細(xì)菌的一項(xiàng)利器，通過(guò)一種類似于注射器的裝置，伯克霍爾德菌將雙鏈脫氨酶注射進(jìn)入其他細(xì)菌胞體內(nèi)，造成基因組的廣泛突變，從而殺死其他細(xì)菌。與David Liu實(shí)驗(yàn)室合作，他們將DddA與另一類基因編輯常用的蛋白TALE相結(jié)合，成功實(shí)現(xiàn)了線粒體DNA的堿基突變2。

然而，這類堿基編輯器的序列兼容性較低，例如最初的堿基編輯器DdCBE只對(duì)T之后的C有較高的編輯效率，編輯后將C突變?yōu)閁，該堿基將被識(shí)別為T。為了解決序列兼容性低的問(wèn)題，領(lǐng)域內(nèi)常用的方法有兩種，一種是工程化改造原有編輯器，另一種是尋找其他種類的堿基編輯器。David Liu等人通過(guò)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化的方法得到了可以編輯A, T和C之后的C的堿基編輯器3，但能夠編輯G之后C的線粒體堿基編輯器仍然缺乏。

汪陽(yáng)明實(shí)驗(yàn)室米黎同學(xué)在研究伯克霍爾德菌DddA的序列和結(jié)構(gòu)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其羧基端存在一段序列，這些序列對(duì)于DddA的脫氨活性十分重要（圖2a）。利用這一重要信息，結(jié)合PSI-BLAST生物信息學(xué)分析手段, 研究者在現(xiàn)有微生物的基因組序列中鑒定了多個(gè)與DddA同源的雙鏈脫氨酶。進(jìn)一步的細(xì)致分析發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于思邈菌( Simiaoa Sunni ; 以中國(guó)唐代“藥王”孫思邈命名)的DddA同源基因(Ddd_Ss)，具有能夠編輯A，T和G之后C的活性（圖2b），從而有可能彌補(bǔ)目前線粒體堿基編輯器的缺口。作者進(jìn)一步出示，利用Ddd_Ss構(gòu)造的線粒體堿基編輯器，成功在多種細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了對(duì)14個(gè)線粒體基因組特定位點(diǎn)的編輯。通過(guò)引入David Liu等人之前發(fā)現(xiàn)的提高脫氨酶活性的突變，作者成功構(gòu)建了模擬Leber遺傳性視神經(jīng)病變中的線粒體基因突變，發(fā)現(xiàn)這些突變會(huì)導(dǎo)致線粒體功能的減弱（圖2c,d）。有意思的是，反過(guò)來(lái)將Ddd_Ss中一個(gè)位點(diǎn)（N1370）引入到伯克霍爾德菌的DddA（Ddd_Bc）時(shí)，成功提高了Ddd_Bc衍生的線粒體堿基編輯器的活性和序列兼容性。這些研究拓展了線粒體堿基編輯器的序列兼容性，并為未來(lái)開發(fā)新的線粒體堿基編輯器提供資源和參考。

圖2. DddA羧基端序列的重要性（a），三種不同來(lái)源的DddA的序列偏好(b)，及經(jīng)Dd_Ss衍生的線粒體堿基編輯器編輯后的細(xì)胞線粒體功能分析（c,d）。

該研究拓展了線粒體堿基編輯器的序列兼容性，但并沒有解決該領(lǐng)域目前廣泛存在的脫靶問(wèn)題，未來(lái)需要更多更精巧的設(shè)計(jì)來(lái)實(shí)現(xiàn)高效和高特異性的編輯；在此之前，線粒體堿基編輯器的應(yīng)用仍然會(huì)面臨挑戰(zhàn)。

北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院博士生米黎和北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心博士生石銘為該論文共同第一作者。該研究得到了北京大學(xué)伊成器、高寧、魏文勝、程和平、王顯花和陳良怡實(shí)驗(yàn)室的指導(dǎo)與幫助；研究由國(guó)家自然科學(xué)基金委和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“干細(xì)胞研究與器官修復(fù)”專項(xiàng)資助，新發(fā)現(xiàn)的雙鏈脫氨酶相關(guān)應(yīng)用申請(qǐng)專利一項(xiàng)。

1 Mi, L. et al. DddA homolog search and engineering expand sequence compatibility of mitochondrial base editing.  Nature Communications 14 (2023). https://doi.org:10.1038/s41467-023-36600-2

2 Mok, B. Y. et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing.  Nature 583, 631-637 (2020). https://doi.org:10.1038/s41586-020-2477-4

3 Mok, B. Y. et al. CRISPR-free base editors with enhanced activity and expanded targeting scope in mitochondrial and nuclear DNA.  Nat Biotechnol (2022). https://doi.org:10.1038/s41587-022-01256-8