子科生物報道:長期以來，DNA甲基化（5mC）作為哺乳動物中最為經(jīng)典的DNA共價修飾被廣泛研究，其對基因表達(dá)調(diào)控、轉(zhuǎn)座子沉默、基因印記以及X染色體失活等生命過程至關(guān)重要。直到2009年，Anjana Rao實驗室在Science首次報道了在哺乳動物細(xì)胞中，存在由一類DNA雙加氧酶Tet1/2/3介導(dǎo)的基于5mC氧化而產(chǎn)生的新的DNA共價修飾——DNA羥甲基化（5hmC）¹；隨后，關(guān)于5hmC的生物學(xué)功能及其意義成為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域有待回答的重大科學(xué)問題之一。經(jīng)過領(lǐng)域內(nèi)十余年的研究，目前關(guān)于5hmC的生物學(xué)功能主要存在兩種觀點：一是5hmC會介導(dǎo)DNA的主動去甲基化，從而產(chǎn)生新的未經(jīng)修飾的胞嘧啶。體外支持證據(jù)來自2011年徐國良教授和張毅教授實驗室分別背靠背發(fā)表于Science上的研究論文^2,3；體內(nèi)支持證據(jù)則是領(lǐng)域內(nèi)代表性的幾個實驗室各自獨立發(fā)現(xiàn)Tet蛋白介導(dǎo)的5mC氧化參與小鼠受精卵和原始生殖細(xì)胞（PGC）中DNA甲基化的擦除⁴。二是5hmC自身也可以介導(dǎo)特定蛋白與DNA的結(jié)合或者去結(jié)合，例如轉(zhuǎn)錄因子或者甲基化CpG結(jié)合蛋白等，從而參與調(diào)控基因的表達(dá)。代表性證據(jù)最早來自于Michiel Vermeulen實驗室2013年發(fā)表在Cell的研究論文，通過定量質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在小鼠胚胎干細(xì)胞（mESC）、神經(jīng)元祖細(xì)胞（NPC）和成年小鼠腦組織中鑒定出了與5hmC結(jié)合或親和結(jié)合5mC的特定蛋白⁵。

　　通過定量質(zhì)譜以及全基因組5hmC測序，人們鑒定出了在胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)元祖細(xì)胞和成年腦組織中5hmC的水平以及基因組分布⁶，為研究5hmC的生物學(xué)功能邁出了關(guān)鍵的一步。近年來，對于DNA甲基化以及部分組蛋白修飾在早期胚胎中的分布與作用已有連續(xù)報道⁷，使得人們對于早期胚胎發(fā)育過程中的關(guān)鍵事件如合子基因組激活和全能性的建立獲得了新的認(rèn)知。然而，關(guān)于5hmC在胚胎發(fā)育中的功能，過去的研究手段局限于細(xì)胞免疫熒光染色，缺乏對該修飾在基因組中分布的細(xì)節(jié)刻畫，使得對于胚胎中5hmC的產(chǎn)生以及作用仍存在較大爭議。備受關(guān)注的爭論之一是受精卵中產(chǎn)生的5hmC是發(fā)生在DNA去甲基化區(qū)域，還是從頭或維持DNA甲基化產(chǎn)生的區(qū)域（Rachel Amouroux, et al., Nat. Cell. Biol., 2016）⁸；其次，盡管5hmC信號在著床前胚胎中會伴隨著DNA的復(fù)制而被逐步稀釋，是否仍有穩(wěn)定的5hmC位點存在？其在基因組上的分布與基因表達(dá)的關(guān)系如何？最后，雖然已知Tet3蛋白介導(dǎo)受精卵中5hmC的產(chǎn)生，其它影響DNA甲基化重編程和5hmC累積的因子仍知之甚少。這些問題不僅限制了人們對5hmC在發(fā)育過程中功能機制的研究，也影響著DNA甲基化重編程如何發(fā)生——這一表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域根本問題的結(jié)論。

　　2022年12月20日，中國科學(xué)院動物研究所郭帆和王紅梅團(tuán)隊合作（中國科學(xué)院動物研究所博士生燕蕊、聯(lián)合培養(yǎng)研究生程馨、博士生徐艷紅、博士生龍鑫和北京昌平實驗室副研究員古嬋為本文共同第一作者），在Nature Genetics發(fā)表了題為Dynamics of DNA hydroxymethylation and methylation during mouse embryonic and germline development的研究論文。研究者對小鼠配子、受精后的著床前胚胎、著床后胚胎和原始生殖細(xì)胞以及體外培養(yǎng)胚胎進(jìn)行了全基因組5hmC的測序分析，通過分離受精卵中的雌雄原核，定量解析了Tet3和DNA復(fù)制對于5hmC產(chǎn)生的影響。此外，研究者通過追蹤父母本基因組，進(jìn)一步揭示了父本和母本基因組之間在5hmC的產(chǎn)生以及分布上的異同。更進(jìn)一步，研究者還發(fā)現(xiàn)了一個影響早期胚胎DNA甲基化重編程和5hmC累積的新因子，并利用敲除小鼠模型結(jié)合化學(xué)小分子抑制劑進(jìn)行了深入解析，為胚胎和生殖細(xì)胞發(fā)育過程中5hmC的調(diào)控和功能提供了新的機制見解。

　　研究者發(fā)現(xiàn)在早期胚胎及生殖細(xì)胞發(fā)育過程中會經(jīng)歷兩次全基因組范圍5hmC的產(chǎn)生（圖1），第一次發(fā)生于受精卵中，偏好性的累積在父本基因組上，并持續(xù)到二細(xì)胞期而在隨后的卵裂過程中被逐漸稀釋，直至囊胚期到達(dá)最低點；第二次發(fā)生于著床后E6.5天胚胎的上胚層細(xì)胞（epiblast）中，對稱產(chǎn)生在父母本基因組中，在E9.5天的PGC中仍維持較高水平，而在隨后階段逐漸降低直至E13.5天達(dá)至最低點。其中，受精卵中產(chǎn)生的5hmC會富集在發(fā)生DNA去甲基化的位點，而不是維持性DNA甲基化或從頭甲基化位點，這為5hmC可作為去甲基化的中間物提供了最為直接的體內(nèi)證據(jù)。著床后胚胎中產(chǎn)生的5hmC則會定位于發(fā)生從頭DNA甲基化的位點，高度富集于增強子（enhancer）中，在PGC發(fā)生DNA去甲基化時逐漸減少。雖然Tet3主導(dǎo)了受精卵中5hmC的產(chǎn)生，DNA復(fù)制也會影響5hmC的生成，尤其是母本基因組受DNA復(fù)制的影響更高。生殖細(xì)胞中建立的DNA甲基化印記位點會在著床前胚胎中繼續(xù)維持，而在PGC階段發(fā)生甲基化擦除。研究者發(fā)現(xiàn)這些印記位點在epiblast或PGC中會有較高水平的5hmC，令人意外的是在受精卵中印記位點上也有顯著水平的5hmC產(chǎn)生。受精后產(chǎn)生的5hmC是否存在可以穩(wěn)定維持的位點？研究者發(fā)現(xiàn)絕大部分位點會伴隨著胚胎發(fā)育進(jìn)程而逐漸丟失5hmC，然而仍有極少數(shù)位點可以維持顯著水平的5hmC直至囊胚期；這些位點對應(yīng)的基因在母本基因組中從卵細(xì)胞開始一直表達(dá)，而在父本基因組中則是從二細(xì)胞起始表達(dá)。

　　5hmC除了可以介導(dǎo)DNA去甲基化，是否還有其它作用？研究者發(fā)現(xiàn)受精后父本基因組產(chǎn)生的5hmC區(qū)域與合子基因組激活基因高度重合，分布于基因的啟動子（promoter）、增強子和基因體（gene body）中。特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點也顯示出5hmC的富集（圖2），Zfp57、Arntl和Ehf結(jié)合位點在卵母細(xì)胞和著床前胚胎的父母本基因組中有5hmC的富集。其中，Zfp57已被報道在小鼠早期胚胎中將DNMTs招募到其目標(biāo)位點，參與印記基因甲基化的維持。Runx2, Nfil3, Thrb, Ebf1和Atf1/2結(jié)合位點在著床前胚胎的父本基因組中顯著富集5hmC。參與小鼠原腸胚形成或早期胚胎器官發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子如Otx2、T、Pou5f1、Nanog、Sox2、Zic2/3和Myc在E6.5天胚胎的epiblast中也顯示出其結(jié)合位點富含5hmC。生殖細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子如Prdm14、Zfx、Zbtb33、Prdm9和Tcf21，其結(jié)合位點在PGC中也高度富集5hmC，這些因子已被報道在生殖細(xì)胞發(fā)育或減數(shù)分裂中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步地，研究者分析了5hmC與特定組蛋白修飾之間的關(guān)聯(lián)（圖2）。受精之后，H3K4me3和H3K36me3修飾區(qū)域會富集5hmC，而H3K9me3和H3K27me3修飾位點通常會排斥5hmC的產(chǎn)生。卵母細(xì)胞中H3K9me2修飾區(qū)域通常與DNA高甲基化區(qū)域在空間上分離，并且從免疫熒光染色的結(jié)果推斷，受精后母本基因組中H3K9me2修飾會抵抗5hmC的產(chǎn)生。研究者發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞中H3K9me2修飾區(qū)域在受精后的確會排斥5hmC的產(chǎn)生，但仍有極少數(shù)位點會含有較高水平的5hmC。

　　小鼠體外培養(yǎng)胚胎（IVC embryos）是研究胚胎著床后形態(tài)發(fā)生和分子事件的替代模型⁹，其基因組中5hmC的產(chǎn)生與分布跟體內(nèi)發(fā)育胚胎相比有何差異？研究者發(fā)現(xiàn)IVC胚胎總體上可以正常發(fā)生從頭DNA甲基化以及基因組范圍5hmC的生成，然而在一些高度富集5hmC且與胚胎形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞分化相關(guān)聯(lián)的基因位點，IVC胚胎則顯示出5hmC產(chǎn)生不足并有著更高水平的DNA甲基化，相關(guān)基因的表達(dá)也會顯著降低（圖3）。這些結(jié)果表明，5hmC參與調(diào)控了E6.5天epiblast中相應(yīng)基因的表達(dá)，并且IVC胚胎中特定基因位點5hmC水平降低可能與其體外發(fā)育受限相關(guān)。

　　除了Tet蛋白，還有哪些因子可能會影響早期胚胎中5hmC的產(chǎn)生和累積？在人類中，多位點印記基因疾?。∕LID）與NLRP家族基因的母源突變以及DNA甲基化異常相關(guān)¹⁰。大多數(shù)人類NLRP基因在小鼠中也具有同源基因，并且Nlrp基因敲除的雌鼠通常顯示出受精后著床前胚胎發(fā)育阻滯，導(dǎo)致不育或生育力降低。有趣的是，Nlrp KO雄鼠生育力則不受影響。研究者根據(jù)這些現(xiàn)象提出了一個問題，即母源缺失Nlrp是否會影響早期胚胎的DNA甲基化重編程。然而，關(guān)于NLRP基因與異常DNA甲基化之間關(guān)聯(lián)的機制卻鮮有文獻(xiàn)報道，特別是在通過利用母源缺失Nlrp的小鼠來追蹤異常DNA甲基化的起源方面。研究者首先系統(tǒng)分析了小鼠從卵細(xì)胞至早期胚胎中所有Nlrp基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)除了已被報道的Nlrp5外，Nlrp14也高表達(dá)于卵細(xì)胞中并呈現(xiàn)出明顯的母源表達(dá)模式。利用Nlrp14 KO的小鼠模型，研究者進(jìn)行了更加深入的分析（圖4）。同Nlrp5 KO小鼠類似，Nlrp14 KO雄鼠可正常生育，而KO雌鼠受精后表現(xiàn)為著床前胚胎發(fā)育阻滯，導(dǎo)致雌性不育。更進(jìn)一步，研究者發(fā)現(xiàn)母源缺失Nlrp14的受精卵中維持性DNA甲基化酶Dnmt1及其輔因子Uhrf1會由細(xì)胞質(zhì)定位轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞核定位，阻礙了DNA復(fù)制關(guān)聯(lián)的DNA被動去甲基化的發(fā)生，導(dǎo)致父本基因組DNA甲基化水平顯著高于正常胚胎。此外，Nlrp14母源KO的胚胎還表現(xiàn)出全基因組染色質(zhì)開放程度顯著降低以及合子基因組激活受阻。受精卵中因Nlrp14缺失使得Dnmt1的活性增強，對5hmC的產(chǎn)生會有怎樣的影響？研究者發(fā)現(xiàn)Nlrp14缺失的早期胚胎中5hmC水平顯著降低，尤其是在原本會發(fā)生DNA去甲基化的區(qū)域。這一實驗證據(jù)也再次表明Tet3介導(dǎo)的5hmC產(chǎn)生與DNA去甲基化緊密關(guān)聯(lián)，而不是偏好性地發(fā)生在維持性DNA甲基化區(qū)域。

　　最后，研究者繼續(xù)探索了Nlrp14是否會影響PGC中DNA甲基化重編程以及配子中DNA甲基化的建立。研究者發(fā)現(xiàn)Nlrp14 KO的胚胎中，PGC的發(fā)育正常且相關(guān)特征基因的表達(dá)也不受影響。同時，Nlrp14 KO的PGC中全基因組DNA甲基化的擦除亦無異常。在Nlrp14 KO后，精子和卵細(xì)胞也可以正常建立DNA甲基化，并且精子和卵子發(fā)生均無明顯異常。這些結(jié)果共同表明Nlrp特異性地參與了受精卵中DNA甲基化重編程并影響Tet3介導(dǎo)的5hmC產(chǎn)生。

　　綜上，該研究系統(tǒng)性地揭示了從小鼠早期胚胎發(fā)育至生殖細(xì)胞發(fā)生過程中5hmC的全基因組分布與分子調(diào)控特征，提出了早期胚胎DNA甲基化重編程的新模式（圖5）。該研究不僅為表觀遺傳領(lǐng)域長期以來的重大爭議問題提供了有力的實驗論證，也為深入理解早期胚胎發(fā)育過程中的表觀遺傳調(diào)控開啟了新維度。