子科生物報(bào)道：蛋白質(zhì)合成是活細(xì)胞中最耗能的過程之一，其精確調(diào)節(jié)成為細(xì)胞經(jīng)濟(jì)的關(guān)鍵問題。雖然在全局基因表達(dá)分析中，通常用 RNA 測序 (RNA-seq) 確定的 mRNA 水平作為分析蛋白質(zhì)合成的替代，但最終蛋白質(zhì)豐度并不總是與 mRNA 水平相關(guān)。這是由于還有mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（小分子RNA (sRNA)）、翻譯調(diào)控、翻譯后修飾等多種調(diào)節(jié)機(jī)制。

在過去十年中，核糖體分析 (Ribo-seq) 已成為在轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)評(píng)估蛋白質(zhì)合成速率和研究翻譯控制機(jī)制的主要方法。Ribo-seq 基于對(duì)核糖體保護(hù)片段 (RPF)——即mRNA上的核糖體結(jié)合位點(diǎn)——進(jìn)行 RNA-seq 分析，這些核糖體覆蓋/結(jié)合的片段能夠在細(xì)胞裂解后的核酸酶處理過程中保留下來。由于每個(gè)核糖體保護(hù)片段代表一個(gè)核糖體的位置，它們的總和不僅揭示了哪些 mRNA，而且還揭示了這些 mRNA 的編碼序列 (CDS) 的哪些部分被翻譯，可用于繪制體內(nèi)主動(dòng)翻譯核糖體的圖譜，以提供有關(guān)翻譯暫停、停滯和翻譯起始位點(diǎn)使用的全局信息，以及蛋白質(zhì)拷貝數(shù)的估計(jì)。

雖然 Ribo-seq 極大地推進(jìn)了翻譯相關(guān)過程的研究，但該方法也有限制。弱表達(dá)基因的覆蓋仍然具有挑戰(zhàn)性，導(dǎo)致許多基因——包括在正常生長條件下具有極低表達(dá)的某些基因類別，例如僅由導(dǎo)致細(xì)胞死亡或生長抑制的特定壓力觸發(fā)表達(dá)的毒素——難以被檢測到。同樣，來自人類腸道的微生物的 Ribo-seq仍然很困難，因?yàn)槠渲性S多無法在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)。在機(jī)制層面上，Ribo-seq 對(duì)那些影響翻譯的分子的研究可能會(huì)受到細(xì)胞反應(yīng)的阻礙。此外，由于 Ribo-seq 是在活細(xì)胞上進(jìn)行的，因此很難剖析對(duì)翻譯的直接和間接影響。

為了克服其中的一些限制，Würzburg大學(xué)(JMU)的一個(gè)研究小組開發(fā)一種新技術(shù)：體外Ribo-seq (INRI-seq)，用于以無細(xì)胞方式進(jìn)行全局翻譯研究。INRI-seq 使用市售的 PURExpress體外翻譯系統(tǒng)，與體外合成的、完全可自定義的轉(zhuǎn)錄組相結(jié)合，可更好地控制單個(gè) mRNA 水平?！拔覀円呀?jīng)開發(fā)了一種技術(shù)，可以用來分析一個(gè)完全可定制的合成轉(zhuǎn)錄組的翻譯景觀，換句話說，一個(gè)細(xì)胞外的轉(zhuǎn)錄組，。。。有了INRI-seq，就不再需要翻譯調(diào)節(jié)物質(zhì)穿過細(xì)胞膜或從大量活細(xì)胞中提取核糖體，”Vogel是JMU分子感染生物學(xué)研究所的主任，也是這項(xiàng)研究的主要作者，他概述了該技術(shù)的優(yōu)勢?！皩?duì)于那些你想研究的、通常很珍貴的材料，比如一種只能小規(guī)模生產(chǎn)的新抗生素，INRI-seq只需要用更少的材料，因此能節(jié)省時(shí)間和金錢。”

實(shí)驗(yàn)成功率高

作者將 INRI-seq 應(yīng)用于合成大腸桿菌轉(zhuǎn)錄組并證明該方法能忠實(shí)地驗(yàn)證已知的翻譯起始位點(diǎn)，并可用于預(yù)測新的翻譯起始位點(diǎn)。與在活細(xì)胞上進(jìn)行的技術(shù)上類似的研究相比，INRI-seq識(shí)別了幾乎四倍多的轉(zhuǎn)譯過程起始位點(diǎn)，顯示出它的高靈敏度。此外，他們使用該系統(tǒng)來研究反義肽核酸 (PNA) 對(duì)翻譯抑制的保真度，證明中靶特異性和定義影響這些短反義寡聚體脫靶效應(yīng)的堿基配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)。INRI-seq 作為一種可擴(kuò)展的靈敏替代方法，具有巨大的潛力，可用于研究其他生物體和生物群落（包括真核生物）中的翻譯控制機(jī)制和翻譯調(diào)節(jié)化合物，可以在轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)研究翻譯起始位點(diǎn)，而不會(huì)因從活細(xì)胞中提取核糖體而產(chǎn)生潛在混淆效應(yīng)。這是迄今為止使用的方法的一個(gè)顯著改進(jìn)，他們?cè)谧钚乱黄诘摹逗怂嵫芯俊冯s志上發(fā)表了他們的研究成果。