背景
癌癥仍然是全世界死亡的主要原因。許多惡性腫瘤的患者要忍受慢性疼痛，晚期肺癌、乳腺癌、前列腺癌或胃腸道癌患者尤甚，這嚴(yán)重影響了他們的生活質(zhì)量。闡明癌癥疼痛的潛在機(jī)制對于指導(dǎo)治療的發(fā)展相當(dāng)重要。

越來越多的證據(jù)表明，包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的許多非神經(jīng)元細(xì)胞類型在痛覺中起著重要作用。有研究提出巨噬細(xì)胞在外周疼痛調(diào)節(jié)中的新作用。在小鼠中耗竭巨噬細(xì)胞，而不是中性粒細(xì)胞或T細(xì)胞，能有效地減少切口的發(fā)展和病原體引起的機(jī)械和熱敏感性，伴隨著炎癥部位白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和其他促痛覺介質(zhì)的下調(diào)。巨噬細(xì)胞也被發(fā)現(xiàn)通過間接釋放抗炎介質(zhì)，如IL-10和專門的促溶解介質(zhì)來影響鎮(zhèn)痛。

研究亮點(diǎn)

香港中文大學(xué)的研究人員成功利用單細(xì)胞RNA測序分析巨噬細(xì)胞在組織炎癥和癌癥條件下轉(zhuǎn)錄組的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)了一種直接促進(jìn)腫瘤神經(jīng)發(fā)生的“巨噬細(xì)胞-神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化”（“macrophage to neuron-like cell transition”，MNT）現(xiàn)象，并在肺癌模型中進(jìn)行了巨噬細(xì)胞耗竭和命運(yùn)定位研究，確定巨噬細(xì)胞特異性Smad3是在基因組水平上促進(jìn)MNT的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子；它的破壞有效地阻斷了腫瘤的神經(jīng)支配和體內(nèi)腫瘤依賴性的傷害行為。因此，“巨噬細(xì)胞-神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化”（MNT）可能是癌癥疼痛的精確治療靶點(diǎn)。

1. 作者用流式分選從LysM-Cre/ROSA-tdTomato小鼠 LLC肺癌模型的腫瘤中分離出巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞，進(jìn)行10×Genomics scRNA-seq分析——單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）是一種在基因組范圍內(nèi)分辨細(xì)胞異質(zhì)性的新興方法，它可以用于分辨發(fā)育過程或者外部刺激過程中的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)時序，這種信息通常在群體分析中被掩蓋了；而在腫瘤微環(huán)境中的轉(zhuǎn)錄組特征和表型是高度動態(tài)的——由于癌細(xì)胞的刺激，巨噬細(xì)胞的表型可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控迅速改變。他們發(fā)現(xiàn)一組高度表達(dá)神經(jīng)元分化標(biāo)志物Tubb3的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM），根據(jù)MetaCore生物信息學(xué)平臺的GO分析（gene ontology），其上調(diào)的差異表達(dá)基因與神經(jīng)元生成高度相關(guān)。研究人員發(fā)現(xiàn)在活體中的這種LLC腫瘤的Tubb3⁺ TAM細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平上表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)缺失，而神經(jīng)生成相關(guān)基因（如Map1b, Syt13, Cyb5d2, Pax6, Cdon, Wnt5a, Pex2等）表達(dá)。雙光子活體成像進(jìn)一步證實(shí)了這種具有神經(jīng)纖維樣形態(tài)的巨噬細(xì)胞譜系(tdTomato+)衍生細(xì)胞的存在，其鈣外排水平(OGB-1+)增強(qiáng)。脂質(zhì)體氯膦酸鹽介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞耗竭消除了LLC腫瘤中這種神經(jīng)元樣亞群的形成，Tubb3⁺ TAM細(xì)胞的存在與癌癥相關(guān)疼痛反應(yīng)行為顯著相關(guān)。

作者還在10×Gnomics的 scRNA-seq人類非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)活檢數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)了TUBB3⁺CD68 TAM亞群（有包括BMP7、SHANK、CHL1和PAX6等神經(jīng)元基因的強(qiáng)表達(dá)）。這個前所未知的TUBB3⁺ TAM亞群顯示出與TUBB3⁺神經(jīng)元細(xì)胞類似的神經(jīng)元樣轉(zhuǎn)錄組特征，與人類神經(jīng)疾病高度相關(guān)。在人腎細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌中也發(fā)現(xiàn)了這種神經(jīng)元樣TAM亞群的存在，并在大規(guī)模的NSCLC患者活檢中進(jìn)一步證實(shí)。通過共聚焦三維成像可視化在NSCLC中的TAM亞群，并通過流式細(xì)胞分析檢測其腫瘤特異性定位，比較NSCLC和正常肺組織，表明TUBB3⁺ TAM亞型在腺癌NSCLC中高度存在，并與人TME中神經(jīng)元分化標(biāo)志物TUBB3的表達(dá)呈正相關(guān)。值得注意的是，TUBB3⁺ TAMs的豐度(TUBB3⁺ CD68⁺/CD68⁺比值> 30%)與老年NSCLC患者較差的生存率顯著相關(guān)，它們上調(diào)的差異表達(dá)基因與神經(jīng)疾病高度相關(guān)(亨廷頓舞蹈病、帕金森病和阿爾茨海默病)，表明這個前所未知的TAM子集對神經(jīng)發(fā)生的潛在貢獻(xiàn)。

2. 為了更好地理解Tubb3⁺ TAM亞群在腫瘤神經(jīng)發(fā)生中的動態(tài)和潛在貢獻(xiàn)，作者使用最新的生物信息學(xué)平臺RNA速率分析—— 一個RNA轉(zhuǎn)錄和剪切的動力學(xué)模型，用于評估單個細(xì)胞從而進(jìn)行最終分化細(xì)胞與親本細(xì)胞之間的因果推斷——對Tubb3⁺TAM數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩種方法（RNA速率和MuTrans分析方法）均證實(shí)Tubb3⁺ TAM亞群來自巨噬細(xì)胞譜系。共聚焦成像技術(shù)在活體LysM^-Cre/ROSA^-tdTomato小鼠LLC腫瘤中觀察到巨噬細(xì)胞系來源的Tubb3⁺細(xì)胞，占流式細(xì)胞術(shù)和圖像分析檢測到的腫瘤Tubb3⁺細(xì)胞總數(shù)的90%以上。為了確認(rèn)巨噬細(xì)胞在TME中直接轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣細(xì)胞的可能性，通過擬時間分析其發(fā)育階段的關(guān)系，結(jié)果證實(shí)了腫瘤微環(huán)境中Tubb3^?Cd68⁺ TAM在轉(zhuǎn)錄水平上完全轉(zhuǎn)變?yōu)門ubb3⁺ Cd68^?神經(jīng)元樣細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)提示了前所未知的“巨噬細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化”(MNT)現(xiàn)象，可能是一種以前未知的豐富的神經(jīng)元樣細(xì)胞來源，可直接促進(jìn)腫瘤神經(jīng)支配。

3. 為更好理解Tubb3⁺TAM亞群在腫瘤神經(jīng)生成中的作用，作者在LLC同源基因肺癌模型的LysM-Cre/iDTR小鼠中進(jìn)行巨噬細(xì)胞耗竭，發(fā)現(xiàn)Tubb3⁺ TAMs顯著減少，通過體內(nèi)的髓源性巨噬細(xì)胞（BMDM）過性轉(zhuǎn)移能成功地逆轉(zhuǎn)LLC腫瘤中的Tubb3⁺ TAMs。他們還發(fā)現(xiàn)體外LLC癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CM)能刺激BMDM中的神經(jīng)元形態(tài)；在TGF-β1刺激下發(fā)現(xiàn)BMDM出現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。TGF-β1預(yù)處理可進(jìn)一步增強(qiáng)癌細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)的BMDM神經(jīng)元形態(tài)。與體外TGF-β1相比，CM刺激的BMDM中檢測到更高表達(dá)的神經(jīng)元分化介質(zhì)(即Tubb3、NeuN和Pou4f1)，表明癌癥條件是啟動“巨噬細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化”(MNT)的關(guān)鍵因素。

對MNTs上調(diào)的差異表達(dá)基因進(jìn)行無偏生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了與神經(jīng)遞質(zhì)釋放和受體表達(dá)相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)。巨噬細(xì)胞譜系scRNA-seq分析顯示，突觸前膜鈣離子傳感器(Syt13和Syt14)、神經(jīng)遞質(zhì)合成酶(Aldh9a1和Dagla)和感覺神經(jīng)元功能標(biāo)記(TrkA和Prph)的表達(dá)在“巨噬細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化”(MNT)中高度富集，提示MNT在腫瘤感覺中可能發(fā)揮的潛在作用，可能導(dǎo)致癌癥疼痛。

用經(jīng)典的傷害性刺激辣椒素(一種TRPV蛋白的激動劑，TRPV蛋白負(fù)責(zé)響應(yīng)癌癥疼痛感)，通過OGB-1成像鈣外流來表征MNTs的生物學(xué)功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMDM衍生的MNTs (Tubb3+ tdTomato+細(xì)胞)有鈣流響應(yīng)，而體外未受刺激的BMDM對照中沒有檢測到響應(yīng)。BMDM來源的MNTs也對GSK1016790A(痛覺受體Trpv4激動劑)和KCl(神經(jīng)元電壓門控鈣通道激動劑)的刺激有反應(yīng)。

將體外產(chǎn)生的BMDM來源的MNTs過繼轉(zhuǎn)移到具有巨噬細(xì)胞功能障礙的非肥胖糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠中，MNTs的局部過繼轉(zhuǎn)移顯著增加了NOD/SCID小鼠的癌癥相關(guān)傷害感受反應(yīng)。在人和小鼠MNT中均能檢測到神經(jīng)元鈣信號(p-CREB和Camk2d)的激活；特別是在MNTs中檢測到疼痛受體Ano1和Trpc1的特異性表達(dá)，以及在體內(nèi)LLC腫瘤中表達(dá)突觸素的MNTs與體外BMDM衍生的MNTs的神經(jīng)回路形成的聯(lián)系，證明了MNTs參與TME促進(jìn)癌癥疼痛。這些數(shù)據(jù)表明，MNTs在腫瘤中可能表現(xiàn)出傷害受體樣活性，這可能是癌癥疼痛的潛在治療靶點(diǎn)。

4.共聚焦顯微鏡證實(shí)了人類NSCLC活檢樣本的MNTs中存在SMAD3的過度激活，另外Opal多重免疫組化染色證實(shí)巨噬細(xì)胞特異性Smad3與人類NSCLC中MNTs的豐富度之間的關(guān)系。因此，作者研究了在實(shí)驗(yàn)性肺癌模型中的Smad3依賴性TME在MNT中的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Smad3敲除(Smad3-KO小鼠)的LLC腫瘤TME中，不僅MNT而且腫瘤相關(guān)的傷害行為也被大幅度抑制，這意味著Smad3依賴性TME在MNT調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。

在體外實(shí)驗(yàn)中，Smad3缺失顯著阻止了LLC癌細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)野生型BMDMs表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物。作者通過將Smad3-野生型(WT)或Smad3-KO型BMDMs轉(zhuǎn)入巨噬細(xì)胞功能障礙的NOD/SCID小鼠LLC肺癌模型中，發(fā)現(xiàn)過繼轉(zhuǎn)移野生型BMDM會顯著增加MNT和癌癥相關(guān)的傷害行為，而過繼轉(zhuǎn)移缺乏Smad3的BMDMs (KO-BMDM)則顯著抑制了MNT，提示Smad3在MNT中的重要性。

使用特異性抑制劑SIS3對Smad3進(jìn)行藥物抑制可以有效地阻斷“巨噬細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化”(MNT)及其相關(guān)的腫瘤神經(jīng)分布(Tubb3⁺和NeuN⁺細(xì)胞)和LLC攜帶小鼠的癌癥相關(guān)的自發(fā)傷害行為。因此，Smad3可能是靶向MNT驅(qū)動的癌癥神經(jīng)發(fā)生的藥物靶點(diǎn)。（子科生物報道）